പൈപ്പറ്റ് ടിപ്പുകളുടെയും ഇപി ട്യൂബുകളുടെയും വന്ധ്യംകരണം മുതലായവ.

1. ഡീയോണൈസ്ഡ് വെള്ളം ഉപയോഗിച്ച് 0.1% (ആയിരത്തിലൊന്ന്) DEPC (ഉയർന്ന വിഷ പദാർത്ഥം) തയ്യാറാക്കുക, അത് ഒരു പുകയിൽ സൂക്ഷിച്ച് ഉപയോഗിക്കുക, വെളിച്ചത്തിൽ നിന്ന് 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സൂക്ഷിക്കുക;

DEPC ജലം DEPC ഉപയോഗിച്ച് ശുദ്ധീകരിക്കുകയും ഉയർന്ന താപനിലയും ഉയർന്ന മർദ്ദവും ഉപയോഗിച്ച് അണുവിമുക്തമാക്കുകയും ചെയ്യുന്ന ശുദ്ധജലമാണ്.RNase, DNase, പ്രോട്ടീനേസ് എന്നിവ ഇല്ലെന്ന് പരിശോധിച്ചു.

2. പൈപ്പറ്റ് ടിപ്പും ഇപി ട്യൂബും 0.1% ഡിഇപിസിയിൽ ഇടുക, പൈപ്പറ്റ് ടിപ്പും ഇപി ട്യൂബും 0.1% ഡിഇപി കൊണ്ട് നിറച്ചിട്ടുണ്ടെന്ന് ഉറപ്പാക്കുക.

3. വെളിച്ചത്തിൽ നിന്ന് സംരക്ഷിക്കുക, ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് നിൽക്കട്ടെ (12-24 മണിക്കൂർ)

4. ടിപ്പും ഇപി ട്യൂബും അടങ്ങിയ ബോക്സ് ഡിഇപിസിയിൽ മുക്കിവയ്ക്കേണ്ടതില്ല.ടിപ്പിലെയോ ഇപി ട്യൂബിലെയോ ഡിഇപിസി വെള്ളം ഏകദേശം നീക്കം ചെയ്ത ശേഷം, അത് പായ്ക്ക് ചെയ്ത് പൊതിയുക.

5. 121 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ്, 30മിനിറ്റ്

6. 180 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ്, മണിക്കൂറുകളോളം ഉണക്കുക (കുറഞ്ഞത് 3 മണിക്കൂർ)

കുറിപ്പ്: എ.DEPC കൈകാര്യം ചെയ്യുമ്പോൾ ലാറ്റക്സ് കയ്യുറകളും മാസ്കുകളും ധരിക്കുക!b, അല്ലെങ്കിൽ DEPC വന്ധ്യംകരണം കൂടാതെ, 130 ℃, 90min ഓട്ടോക്ലേവ് (പല ലബോറട്ടറികളിലും ഉയർന്ന താപനിലയിൽ രണ്ടുതവണ വന്ധ്യംകരണം)

RNA വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ പരിഗണനകൾ

ടിഷ്യു ആർഎൻഎ ഒറ്റപ്പെടൽ പരാജയത്തിന്റെ രണ്ട് പ്രധാന പ്രതിഭാസങ്ങൾ

ആർഎൻഎ ഡീഗ്രഡേഷനും ടിഷ്യൂകളിലെ മാലിന്യങ്ങളുടെ അവശിഷ്ടങ്ങളും,നശീകരണത്തെക്കുറിച്ച്, സംസ്ക്കരിച്ച കോശങ്ങളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്ന ആർഎൻഎ എന്തുകൊണ്ട് എളുപ്പത്തിൽ നശിപ്പിക്കപ്പെടുന്നില്ല എന്ന് നോക്കാം.നിലവിലുള്ള RNA എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷൻ റിയാക്ടറുകൾ എല്ലാം തന്നെ RNase-നെ അതിവേഗം തടയുന്ന ഘടകങ്ങൾ ഉൾക്കൊള്ളുന്നു.സംസ്ക്കരിച്ച കോശങ്ങളിലേക്ക് ലൈസേറ്റ് ചേർക്കുക, അത് ലളിതമായി മിക്സ് ചെയ്യുക, എല്ലാ കോശങ്ങളും ലൈസേറ്റുമായി നന്നായി കലർത്താം, കൂടാതെ കോശങ്ങൾ പൂർണ്ണമായും ലൈസ് ചെയ്യപ്പെടും.കോശങ്ങൾ ലൈസ് ചെയ്ത ശേഷം, ലൈസെറ്റിലെ സജീവ ഘടകങ്ങൾ ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ ആർ‌നേസിനെ ഉടൻ തടയുന്നു, അതിനാൽ ആർ‌എൻ‌എ കേടുകൂടാതെയിരിക്കും.അതായത്, സംസ്ക്കരിച്ച കോശങ്ങൾ ലൈസേറ്റുമായി എളുപ്പത്തിലും പൂർണ്ണമായും സമ്പർക്കം പുലർത്തുന്നതിനാൽ, അവയുടെ ആർഎൻഎ എളുപ്പത്തിൽ നശിപ്പിക്കപ്പെടുന്നില്ല;മറുവശത്ത്, ടിഷ്യൂയിലെ കോശങ്ങൾക്ക് ലൈസേറ്റുമായി പെട്ടെന്ന് ബന്ധപ്പെടാൻ എളുപ്പമല്ലാത്തതിനാൽ ടിഷ്യൂയിലെ ആർഎൻഎ എളുപ്പത്തിൽ നശിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു.മതിയായ കോൺടാക്റ്റ് കാരണം.അതിനാൽ,ആർ‌എൻ‌എ പ്രവർത്തനത്തെ തടയുമ്പോൾ ടിഷ്യുവിനെ ഒരൊറ്റ കോശമാക്കി മാറ്റാൻ ഒരു മാർഗമുണ്ടെന്ന് ഊഹിച്ചാൽ, നശീകരണ പ്രശ്നം പൂർണ്ണമായും പരിഹരിക്കാനാകും.

ലിക്വിഡ് നൈട്രജൻ മില്ലിംഗ് ആണ് ഇത്തരത്തിലുള്ള ഏറ്റവും ഫലപ്രദമായ രീതി.എന്നിരുന്നാലും, ലിക്വിഡ് നൈട്രജൻ മില്ലിംഗ് രീതി വളരെ ബുദ്ധിമുട്ടാണ്, പ്രത്യേകിച്ച് സാമ്പിളുകളുടെ എണ്ണം വലുതായിരിക്കുമ്പോൾ.ഇത് അടുത്ത മികച്ച കാര്യത്തിന് കാരണമായി: ഹോമോജെനൈസർ.ദിഹോമോജെനൈസർകോശങ്ങൾ ലൈസേറ്റുമായി ബന്ധപ്പെടുന്നതിന് മുമ്പ് RNase പ്രവർത്തനം എങ്ങനെ തടയപ്പെടുന്നു എന്ന ചോദ്യം ഈ രീതി പരിഗണിക്കുന്നില്ല, പകരം ടിഷ്യു തടസ്സത്തിന്റെ നിരക്ക് ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ RNase RN ഡിഗ്രേഡ് ചെയ്യുന്ന നിരക്കിനേക്കാൾ വേഗത്തിലായിരിക്കണമെന്ന് പ്രാർത്ഥിക്കുന്നു.

ഇലക്ട്രിക് ഹോമോജെനൈസറിന്റെ പ്രഭാവം മികച്ചതാണ്,ഗ്ലാസ് ഹോമോജെനൈസറിന്റെ പ്രഭാവം മോശമാണ്, എന്നാൽ പൊതുവേ, ഹോമോജെനൈസർ രീതിക്ക് ഡീഗ്രഡേഷൻ പ്രതിഭാസത്തെ തടയാൻ കഴിയില്ല.അതിനാൽ, വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ ഡീഗ്രേഡാണെങ്കിൽ, ലിക്വിഡ് നൈട്രജൻ ഉപയോഗിച്ച് പൊടിക്കുന്നതിന് യഥാർത്ഥ ഇലക്ട്രിക് ഹോമോജെനൈസർ ഉപയോഗിക്കണം;ഒറിജിനൽ ഗ്ലാസ് ഹോമോജെനൈസർ ഒരു ഇലക്ട്രിക് ഹോമോജെനൈസർ ആക്കി മാറ്റണം അല്ലെങ്കിൽ ലിക്വിഡ് നൈട്രജൻ ഉപയോഗിച്ച് നേരിട്ട് കുഴയ്ക്കണം.പ്രശ്നം ഏതാണ്ട് 100% പ്രായോഗികമാണ്.പരിഹരിക്കപ്പെടും.

തുടർന്നുള്ള പരീക്ഷണങ്ങളെ ബാധിക്കുന്ന അശുദ്ധി അവശിഷ്ട പ്രശ്‌നത്തിന് ഡീഗ്രേഡേഷനേക്കാൾ വൈവിധ്യമാർന്ന കാരണങ്ങളുണ്ട്, കൂടാതെ പരിഹാരങ്ങളും അതിനനുസരിച്ച് വ്യത്യസ്തമാണ്.ഉപസംഹാരമായി,ടിഷ്യൂവിൽ ഡീഗ്രേഡേഷനോ അവശിഷ്ടമായ മാലിന്യങ്ങളോ ഉണ്ടെങ്കിൽ, പ്രത്യേക പരീക്ഷണ പദാർത്ഥത്തിനായുള്ള എക്സ്ട്രാക്ഷൻ രീതി/റിയാജൻറ് ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യണം.ഒപ്റ്റിമൈസേഷനായി നിങ്ങളുടെ വിലയേറിയ സാമ്പിളുകൾ ഉപയോഗിക്കേണ്ടതില്ല: നിങ്ങൾക്ക് മാർക്കറ്റിൽ നിന്ന് മത്സ്യം/ചിക്കൻ പോലുള്ള ചില ചെറിയ മൃഗങ്ങൾ വാങ്ങാം, ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കാനുള്ള മെറ്റീരിയലിന്റെ അനുബന്ധ ഭാഗം എടുക്കാം, പ്രോട്ടീൻ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ മറ്റൊരു ഭാഗം - വായ, ആമാശയം, കുടൽ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് പൊടിക്കുക.

വേർതിരിച്ചെടുത്ത ആർഎൻഎയുടെ ടാർഗെറ്റ് ആർഎൻഎ വിവിധ തുടർ പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി ഉപയോഗിക്കുന്നു, അതിന്റെ ഗുണനിലവാര ആവശ്യകതകൾ വ്യത്യസ്തമാണ്

cDNA ലൈബ്രറി നിർമ്മാണത്തിന് എൻസൈം റിയാക്ഷൻ ഇൻഹിബിറ്ററുകളുടെ അവശിഷ്ടങ്ങളില്ലാതെ RNA സമഗ്രത ആവശ്യമാണ്;എൻസൈം റിയാക്ഷൻ ഇൻഹിബിറ്ററുകളുടെ അവശിഷ്ടങ്ങൾക്ക് നോർത്തേണിന് ഉയർന്ന ആർഎൻഎ സമഗ്രതയും കുറഞ്ഞ ആവശ്യകതകളും ആവശ്യമാണ്;ആർടി-പിസിആറിന് ഉയർന്ന ആർഎൻഎ സമഗ്രത ആവശ്യമില്ല,എന്നാൽ എൻസൈം പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളെ തടയുന്നു.അവശിഷ്ട ആവശ്യകതകൾ കർശനമാണ്.ഇൻപുട്ട് ഔട്ട്പുട്ട് നിർണ്ണയിക്കുന്നു;ഓരോ തവണയും ഏറ്റവും ഉയർന്ന ശുദ്ധിയുള്ള RNA നേടുക എന്നതാണ് ലക്ഷ്യം, അത് ജനങ്ങൾക്കും പണത്തിനും ചിലവാകും.

സാമ്പിളുകളുടെ ശേഖരണം/സംഭരണം

ജീർണ്ണതയെ ബാധിക്കുന്ന ഘടകങ്ങൾ ജീവശരീരത്തിൽ നിന്ന്/അല്ലെങ്കിൽ യഥാർത്ഥ വളർച്ചാ പരിതസ്ഥിതിയിൽ നിന്ന് സാമ്പിൾ വിട്ടശേഷം, സാമ്പിളിലെ എൻഡോജെനസ് എൻസൈമുകൾ ആർഎൻഎയെ നശിപ്പിക്കാൻ തുടങ്ങും,ഡീഗ്രഡേഷൻ നിരക്ക് എൻഡോജെനസ് എൻസൈമുകളുടെയും താപനിലയുടെയും ഉള്ളടക്കവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.പരമ്പരാഗതമായി, എൻഡോജെനസ് എൻസൈം പ്രവർത്തനത്തെ പൂർണ്ണമായും തടയാൻ രണ്ട് വഴികളേ ഉള്ളൂ: ഉടനടി ലൈസേറ്റ് ചേർക്കുകയും സമഗ്രമായും വേഗത്തിലും ഏകീകരിക്കുകയും ചെയ്യുക;ചെറിയ കഷണങ്ങളായി മുറിച്ച് ഉടൻ ദ്രാവക നൈട്രജനിൽ ഫ്രീസ് ചെയ്യുക.രണ്ട് സമീപനങ്ങൾക്കും വേഗത്തിലുള്ള പ്രവർത്തനം ആവശ്യമാണ്.രണ്ടാമത്തേത് എല്ലാ സാമ്പിളുകൾക്കും അനുയോജ്യമാണ്, അതേസമയം ആദ്യത്തേത് കോശങ്ങളുടെയും എൻഡോജെനസ് എൻസൈമുകളുടെയും കുറഞ്ഞ ഉള്ളടക്കമുള്ളതും ഏകതാനമാക്കാൻ എളുപ്പമുള്ളതുമായ ടിഷ്യൂകൾക്ക് മാത്രമേ അനുയോജ്യമാകൂ.പ്രത്യേകമായി, സസ്യകലകൾ, കരൾ, തൈമസ്, പാൻക്രിയാസ്, പ്ലീഹ, മസ്തിഷ്കം, കൊഴുപ്പ്, പേശി ടിഷ്യു മുതലായവ തുടരുന്നതിന് മുമ്പ് ലിക്വിഡ് നൈട്രജൻ ഉപയോഗിച്ച് ഫ്രീസുചെയ്യുന്നതാണ് നല്ലത്.

സാമ്പിളുകളുടെ വിഘടനവും ഏകീകരണവും

ഡീഗ്രഡേഷനെയും യീൽഡ് സാമ്പിൾ വിഘടനത്തെയും ബാധിക്കുന്ന ഘടകങ്ങൾസമഗ്രമായ ഏകീകരണത്തിനായി, ഇത് RNA യുടെ പൂർണ്ണവും പൂർണ്ണവുമായ റിലീസിനുള്ളതാണ്.കോശങ്ങൾ തകർക്കപ്പെടാതെ നേരിട്ട് ഏകതാനമാക്കാം.തകർന്നതിനുശേഷം മാത്രമേ ടിഷ്യുകൾ ഏകതാനമാക്കാൻ കഴിയൂ.യീസ്റ്റും ബാക്ടീരിയയും ഹോമോജെനൈസ് ചെയ്യപ്പെടുന്നതിന് മുമ്പ് അവയെ അനുബന്ധ എൻസൈമുകൾ ഉപയോഗിച്ച് തകർക്കേണ്ടതുണ്ട്.എൻഡോജെനസ് എൻസൈം ഉള്ളടക്കം കുറവുള്ളതും എളുപ്പമുള്ള ഹോമോജെനൈസേഷനുമുള്ള ടിഷ്യൂകൾ ഒരു ഹോമോജെനൈസർ വഴി ലൈസേറ്റിൽ ഒരേസമയം ചതച്ച് ഏകതാനമാക്കാം;പ്ലാന്റ് ടിഷ്യു, കരൾ, തൈമസ്, പാൻക്രിയാസ്, പ്ലീഹ, മസ്തിഷ്കം, കൊഴുപ്പ്, പേശി ടിഷ്യു, മറ്റ് സാമ്പിളുകൾ, അവ ഒന്നുകിൽ എൻഡോജെനസ് എൻസൈമുകളിൽ ഉയർന്നതാണ് അല്ലെങ്കിൽ എളുപ്പത്തിൽ ഏകീകരിക്കപ്പെടാത്തവയാണ്.അതിനാൽ ടിഷ്യു തടസ്സപ്പെടുത്തലും ഏകതാനമാക്കലും പ്രത്യേകം നടത്തണം.ഫ്രാഗ്മെന്റേഷന്റെ ഏറ്റവും വിശ്വസനീയവും ഉൽപ്പാദനക്ഷമവുമായ രീതി ദ്രാവക നൈട്രജൻ ഉപയോഗിച്ച് മില്ലിംഗ് ആണ്, കൂടാതെ ഏറ്റവും വിശ്വസനീയമായ ഏകീകൃത രീതി ഒരു ഇലക്ട്രിക് ഹോമോജെനൈസർ ആണ്.ലിക്വിഡ് നൈട്രജൻ ഉപയോഗിച്ച് മില്ലിംഗ് ചെയ്യുന്നതിനെക്കുറിച്ചുള്ള ഒരു പ്രത്യേക കുറിപ്പ്: മുഴുവൻ മില്ലിംഗ് പ്രക്രിയയിലും സാമ്പിൾ ഉരുകാൻ പാടില്ല, കാരണം ഫ്രീസ് ചെയ്യുമ്പോൾ എൻഡോജെനസ് എൻസൈമുകൾ പ്രവർത്തിക്കാൻ സാധ്യതയുണ്ട്.

ലൈസറ്റിന്റെ തിരഞ്ഞെടുപ്പ്

പ്രവർത്തനത്തിന്റെ സൗകര്യത്തെയും ശേഷിക്കുന്ന എൻഡോജെനസ് മാലിന്യങ്ങളുടെ ഘടകങ്ങളെയും ബാധിക്കുന്നു.അതിനാൽ, ഒരു ലിസിസ് പരിഹാരം തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിനുള്ള പ്രധാന കാര്യം ശുദ്ധീകരണ രീതിയുമായി സംയോജിച്ച് പരിഗണിക്കുക എന്നതാണ്.ഒരു അപവാദം ഉണ്ട്:ഉയർന്ന എൻഡോജെനസ് എൻസൈം ഉള്ളടക്കമുള്ള സാമ്പിളുകൾ എൻഡോജെനസ് എൻസൈമുകളെ നിർജ്ജീവമാക്കാനുള്ള കഴിവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് ഫിനോൾ അടങ്ങിയ ലൈസേറ്റ് ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

ശുദ്ധീകരണ രീതിയുടെ തിരഞ്ഞെടുപ്പ്

ശേഷിക്കുന്ന എൻഡോജെനസ് മാലിന്യങ്ങളെ ബാധിക്കുന്ന ഘടകങ്ങൾ, വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ വേഗത കോശങ്ങൾ പോലെയുള്ള ശുദ്ധമായ സാമ്പിളുകൾക്ക്, കൈയിലുള്ള ഏത് ശുദ്ധീകരണ രീതിയിലും തൃപ്തികരമായ ഫലങ്ങൾ ലഭിക്കും.എന്നാൽ മറ്റ് പല സാമ്പിളുകൾക്കും, പ്രത്യേകിച്ച് സസ്യങ്ങൾ, കരൾ, ബാക്ടീരിയ മുതലായവ ഉയർന്ന അളവിലുള്ള മാലിന്യങ്ങൾ ഉള്ളവയ്ക്ക്, അനുയോജ്യമായ ഒരു ശുദ്ധീകരണ രീതി തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നത് നിർണായകമാണ്.കോളം സെൻട്രിഫ്യൂഗൽ പ്യൂരിഫിക്കേഷൻ രീതിക്ക് അതിവേഗ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ വേഗതയുണ്ട്, കൂടാതെ ആർഎൻഎയുടെ തുടർന്നുള്ള എൻസൈമാറ്റിക് പ്രതികരണത്തെ ബാധിക്കുന്ന മാലിന്യങ്ങളെ ഫലപ്രദമായി നീക്കം ചെയ്യാൻ കഴിയും, എന്നാൽ ഇത് ചെലവേറിയതാണ് (ഫോറെജീനിന് ചെലവ് കുറഞ്ഞ കിറ്റുകൾ വാഗ്ദാനം ചെയ്യാൻ കഴിയും, കൂടുതൽ വിശദാംശങ്ങൾ ക്ലിക്ക് ചെയ്യുകഇവിടെ);LiCl മഴ പോലുള്ള സാമ്പത്തികവും ക്ലാസിക് ശുദ്ധീകരണ രീതികളും ഉപയോഗിച്ച് തൃപ്തികരമായ ഫലങ്ങൾ ലഭിക്കും, എന്നാൽ പ്രവർത്തന സമയം ദൈർഘ്യമേറിയതാണ്..

ആർ‌എൻ‌എ എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷനുള്ള “മൂന്ന് അച്ചടക്കങ്ങളും എട്ട് ശ്രദ്ധയും”

അച്ചടക്കം 1:എക്സോജനസ് എൻസൈമുകളുടെ മലിനീകരണം അവസാനിപ്പിക്കുക.

കുറിപ്പ് 1:മാസ്കുകളും കയ്യുറകളും കർശനമായി ധരിക്കുക.

കുറിപ്പ് 2:പരീക്ഷണത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബുകൾ, ടിപ്പ് ഹെഡ്‌സ്, പൈപ്പറ്റ് റോഡുകൾ, ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസ് ടാങ്കുകൾ, പരീക്ഷണ ബെഞ്ചുകൾ എന്നിവ നന്നായി നീക്കം ചെയ്യണം.

കുറിപ്പ് 3:പരീക്ഷണത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന റിയാഗന്റുകൾ/പരിഹാരങ്ങൾ, പ്രത്യേകിച്ച് വെള്ളം, RNase-രഹിതമായിരിക്കണം.

അച്ചടക്കം 2:എൻഡോജെനസ് എൻസൈമുകളുടെ പ്രവർത്തനം തടയുക

കുറിപ്പ് 4:അനുയോജ്യമായ ഒരു ഏകീകൃത രീതി തിരഞ്ഞെടുക്കുക.

കുറിപ്പ് 5:അനുയോജ്യമായ ഒരു ലൈസേറ്റ് തിരഞ്ഞെടുക്കുക.

കുറിപ്പ് 6:സാമ്പിളിന്റെ ആരംഭ അളവ് നിയന്ത്രിക്കുക.

അച്ചടക്കം 3:നിങ്ങളുടെ എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷൻ ഉദ്ദേശം വ്യക്തമാക്കുക

കുറിപ്പ് 7:ഏതൊരു ലൈസേറ്റ് സിസ്റ്റവും സാമ്പിളിന്റെ പരമാവധി ആരംഭ അളവിലേക്ക് അടുക്കുമ്പോൾ, വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ വിജയ നിരക്ക് കുത്തനെ കുറയുന്നു.

കുറിപ്പ് 8:വിജയകരമായ ആർ‌എൻ‌എ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിനുള്ള ഏക സാമ്പത്തിക മാനദണ്ഡം തുടർന്നുള്ള പരീക്ഷണങ്ങളിലെ വിജയമാണ്, വിളവെടുപ്പല്ല.

RNase മലിനീകരണത്തിന്റെ മികച്ച 10 ഉറവിടങ്ങൾ

1. എക്സോജനസ് എൻസൈമുകളുടെ ആദ്യ ഉറവിടം വിരലുകളാണ്, അതിനാൽ കയ്യുറകൾ ഇടയ്ക്കിടെ ധരിക്കുകയും മാറ്റുകയും വേണം.കൂടാതെ, മാസ്കുകളും ധരിക്കേണ്ടതാണ്, കാരണം ശ്വസനം എൻസൈമുകളുടെ ഒരു പ്രധാന ഉറവിടമാണ്.ഒരു ഗ്ലൗസ് മാസ്ക് ധരിക്കുന്നതിന്റെ ഒരു അധിക നേട്ടം പരീക്ഷണം നടത്തുന്നയാളെ സംരക്ഷിക്കുക എന്നതാണ്.

2. പൈപ്പറ്റ് ടിപ്പുകൾ, സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബുകൾ, പൈപ്പറ്റുകൾ - വന്ധ്യംകരണം കൊണ്ട് മാത്രം RNase നിർജ്ജീവമാക്കാൻ കഴിയില്ല, അതിനാൽ പൈപ്പറ്റ് നുറുങ്ങുകളും സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബുകളും DEPC ആയി അടയാളപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ടെങ്കിലും DEPC ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കണം.ഒരു പ്രത്യേക ആവശ്യത്തിനുള്ള പൈപ്പറ്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്, ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് 75% ആൽക്കഹോൾ കോട്ടൺ ബോൾ ഉപയോഗിച്ച് തുടയ്ക്കുക, പ്രത്യേകിച്ച് വടി;കൂടാതെ, ഒരു ഹെഡ് റിമൂവർ ഉപയോഗിക്കാതിരിക്കാൻ ശ്രദ്ധിക്കുക.

3. വെള്ളം/ബഫർ RNase മലിനീകരണം ഇല്ലാത്തതായിരിക്കണം.

4. ടെസ്റ്റ് ടേബിളെങ്കിലും 75% ആൽക്കഹോൾ കോട്ടൺ ബോളുകൾ ഉപയോഗിച്ച് തുടയ്ക്കണം.

5.എൻഡോജെനസ് RNase എല്ലാ ടിഷ്യൂകളിലും എൻഡോജെനസ് എൻസൈമുകൾ അടങ്ങിയിട്ടുണ്ട്, അതിനാൽ ദ്രാവക നൈട്രജൻ ഉപയോഗിച്ച് ടിഷ്യൂകൾ വേഗത്തിൽ മരവിപ്പിക്കുന്നതാണ് ഡീഗ്രഡേഷൻ കുറയ്ക്കുന്നതിനുള്ള ഏറ്റവും നല്ല മാർഗം.ലിക്വിഡ് നൈട്രജൻ സ്റ്റോറേജ്/ഗ്രൈൻഡിംഗ് രീതി തീർച്ചയായും അസൗകര്യമാണ്, എന്നാൽ ഉയർന്ന അളവിലുള്ള എൻഡോജെനസ് എൻസൈമുകളുള്ള ടിഷ്യൂകൾക്കുള്ള ഒരേയൊരു മാർഗ്ഗമാണിത്.

6. RNA സാമ്പിളുകൾ RNA വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ ഉൽപ്പന്നങ്ങളിൽ RNase മലിനീകരണത്തിന്റെ സൂചനകൾ അടങ്ങിയിരിക്കാം.

7. പ്ലാസ്മിഡ് വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ പ്ലാസ്മിഡ് വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ ആർഎൻഎയെ തരംതാഴ്ത്താൻ പലപ്പോഴും Rnase ഉപയോഗിക്കുന്നു, ശേഷിക്കുന്ന Rnase പ്രോട്ടീനേസ് കെ ഉപയോഗിച്ച് ദഹിപ്പിക്കുകയും പിസിഐ വേർതിരിച്ചെടുക്കുകയും വേണം.

8. ആർഎൻഎ സംഭരണം താഴ്ന്ന ഊഷ്മാവിൽ സൂക്ഷിക്കുകയാണെങ്കിൽപ്പോലും, ആർഎൻഎസിന്റെ അളവ് കുറയുന്നത് ആർഎൻഎ അപചയത്തിന് കാരണമാകും.ആർഎൻഎയുടെ ദീർഘകാല സംരക്ഷണത്തിനുള്ള ഏറ്റവും നല്ല പരിഹാരം ഉപ്പ്/മദ്യം സസ്പെൻഷനാണ്, കാരണം മദ്യം കുറഞ്ഞ താപനിലയിൽ എല്ലാ എൻസൈമാറ്റിക് പ്രവർത്തനങ്ങളെയും തടയുന്നു.

9. കാറ്റേഷനുകളിൽ (Ca, Mg) ഈ അയോണുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുമ്പോൾ, 80C യിൽ 5 മിനിറ്റ് ചൂടാക്കുന്നത് RNA പിളരുന്നതിന് കാരണമാകും, അതിനാൽ RNA ചൂടാക്കണമെങ്കിൽ, സംരക്ഷണ ലായനിയിൽ ഒരു ചേലേറ്റിംഗ് ഏജന്റ് (1mM സോഡിയം സിട്രേറ്റ്, pH 6.4) അടങ്ങിയിരിക്കണം.

10. തുടർന്നുള്ള പരീക്ഷണങ്ങളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന എൻസൈമുകൾ RNase വഴി മലിനമായേക്കാം.

ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിനുള്ള 10 നുറുങ്ങുകൾ

1: RNase പ്രവർത്തനം വേഗത്തിൽ തടയുക.ശേഖരണത്തിന് ശേഷം സാമ്പിളുകൾ പെട്ടെന്ന് മരവിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ ലിസിസ് സമയത്ത് ദ്രുതഗതിയിലുള്ള പ്രവർത്തനത്തിലൂടെ RNase നിർജ്ജീവമാകുന്നു.

2: ഉയർന്ന റൈബോസൈം ഉള്ളടക്കമുള്ള ടിഷ്യൂകൾക്കായി ഉചിതമായ ഒരു വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ രീതി തിരഞ്ഞെടുക്കുക, അഡിപ്പോസ് ടിഷ്യു ഫിനോൾ അടങ്ങിയ രീതി ഉപയോഗിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.

3: പ്രവചന നിലവാരത്തിന് നോർത്തേൺ ആവശ്യമാണ്, cDNA ലൈബ്രറി നിർമ്മാണത്തിന് ഉയർന്ന സമഗ്രത ആവശ്യമാണ്, കൂടാതെ RT-PCR, RPA (Ribonuclease protection assay) എന്നിവയ്ക്ക് ഉയർന്ന സമഗ്രത ആവശ്യമില്ല.RT-PCR ന് ഉയർന്ന പരിശുദ്ധി ആവശ്യമാണ് (എൻസൈം ഇൻഹിബിറ്റർ അവശിഷ്ടങ്ങൾ).

4: വിളവ് മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനും നശീകരണം കുറയ്ക്കുന്നതിനുമുള്ള താക്കോലാണ് സമഗ്രമായ ഏകീകരണം.

5: RNA ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് കണ്ടെത്തലിന്റെ സമഗ്രത പരിശോധിക്കുക, 28S: 18S = 2: 1 എന്നത് ഒരു പൂർണ്ണമായ അടയാളമാണ്, 1: 1 എന്നത് മിക്ക പരീക്ഷണങ്ങൾക്കും സ്വീകാര്യമാണ്.

6: RT-PCR-നുള്ള ഡിഎൻഎ നീക്കംചെയ്യൽ, അറേ വിശകലനം ഡിഎൻഎ നീക്കം ചെയ്യാൻ Dnase I ഉപയോഗിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.

7: എക്സോജനസ് എൻസൈമുകളുടെ മലിനീകരണം കുറയ്ക്കുക - എൻസൈമുകൾ പുറത്തു നിന്ന് ഇറക്കുമതി ചെയ്യാൻ കഴിയില്ല.

8: കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയുള്ള ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് കേന്ദ്രീകരിക്കുമ്പോൾ, ഒരു കോ-പ്രിസിപിറ്റേഷൻ റിയാജന്റ് ചേർക്കണം.എന്നാൽ എൻസൈമുകളും ഡിഎൻഎ മലിനീകരണവും അടങ്ങിയ കോ-പ്രിസിപിറ്റന്റ് തടയാൻ.

9: ആർഎൻഎ നന്നായി അലിയിക്കുക, ആവശ്യമെങ്കിൽ 65 സിയിൽ 5 മിനിറ്റ് ചൂടാക്കുക.

അനുയോജ്യമായ സംഭരണ ​​രീതി

ഇത് -20C-യിൽ കുറച്ച് സമയത്തേക്ക്, -80C-യിൽ വളരെക്കാലം സൂക്ഷിക്കാം.വ്യത്യസ്ത സാമ്പിളുകളുടെ ആർഎൻഎ ഉള്ളടക്കം വളരെയധികം വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് മനസ്സിലാക്കുക എന്നതാണ് ആർഎൻഎ വിളവ് മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനുള്ള ആദ്യപടി.കരൾ, പാൻക്രിയാസ്, ഹൃദയം, മസ്തിഷ്കം, ഭ്രൂണം, വൃക്ക, ശ്വാസകോശം, തൈമസ്, അണ്ഡാശയം, കുറഞ്ഞ സമൃദ്ധി (<0.05ug/mg) മില്ലിഗ്രാം, മൂത്രസഞ്ചി, അസ്ഥി, കൊഴുപ്പ് തുടങ്ങിയ ഇടത്തരം സമൃദ്ധി (0.05-2ug/mg) പോലുള്ള ഉയർന്ന സമൃദ്ധി (2-4ug/mg).

1: RN റിലീസ് ചെയ്യാൻ ലൈസ് സെല്ലുകൾ - RNA റിലീസ് ചെയ്തില്ലെങ്കിൽ, വിളവ് കുറയും.ഇലക്‌ട്രിക് ഹോമോജനൈസേഷൻ മറ്റ് ഹോമോജനൈസേഷൻ രീതികളേക്കാൾ മികച്ച രീതിയിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്നു, എന്നാൽ ലിക്വിഡ് നൈട്രജൻ മാഷിംഗ്, എൻസൈമാറ്റിക് ഡൈജഷൻ (ലൈസോസൈം/ലൈറ്റിക്കേസ്) പോലുള്ള മറ്റ് രീതികളുമായി സംയോജിപ്പിക്കേണ്ടതുണ്ട്.

2: വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ രീതിയുടെ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ.ഫിനോൾ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള രീതികളിലെ ഏറ്റവും വലിയ പ്രശ്നങ്ങൾ അപൂർണ്ണമായ സ്‌ട്രാറ്റിഫിക്കേഷനും ഭാഗിക ആർഎൻഎ നഷ്‌ടവുമാണ് (സൂപ്പർനാറ്റന്റ് പൂർണ്ണമായും നീക്കം ചെയ്യാൻ കഴിയില്ല).ഉയർന്ന ന്യൂക്ലിക് ആസിഡും പ്രോട്ടീനും ഉള്ളതിനാലാണ് അപൂർണ്ണമായ സ്‌ട്രിഫിക്കേഷൻ, ഉപയോഗിച്ച ലൈസേറ്റിന്റെ അളവ് കൂട്ടുകയോ സാമ്പിളിന്റെ അളവ് കുറയ്ക്കുകയോ ചെയ്‌ത് പരിഹരിക്കാൻ കഴിയും.ക്ലോറോഫോം വേർതിരിച്ചെടുക്കലിന്റെ ഒരു ഘട്ടം അഡിപ്പോസ് ടിഷ്യുവിലേക്ക് ചേർത്തു.ബാക്ക്-പമ്പിംഗ് വഴിയോ ഓർഗാനിക് പാളി നീക്കം ചെയ്തോ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴിയോ ആർഎൻഎ നഷ്ടം കുറയ്ക്കാം.കോളം സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള രീതികളിലെ ഏറ്റവും വലിയ പ്രശ്നം അധിക സാമ്പിളാണ്.

ക്ലാസിക് എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷൻ ടിപ്പുകൾ

1. ഫിനോൾ ശുദ്ധീകരണം: 1: 1 ഫിനോൾ / ക്ലോറോഫോം തുല്യ അളവിൽ ചേർത്ത് 1-2 മിനിറ്റ് ശക്തമായി ഇളക്കുക.2 മിനിറ്റ് ഉയർന്ന വേഗതയിൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ്.സൂപ്പർനാറ്റന്റ് (80-90%) ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം നീക്കം ചെയ്യുക.മധ്യ പാളിയിലേക്ക് ഒരിക്കലും എത്തരുത്.പ്രതിപ്രവർത്തന ലായനിയുടെ തുല്യ അളവ് ഫിനോൾ/ക്ലോറോഫോമിൽ ചേർത്ത് സൂപ്പർനറ്റന്റ് നീക്കം ചെയ്യാം.വിളവ് മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിന് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് മഴയ്ക്കായി രണ്ട് സൂപ്പർനാറ്റന്റുകളും ഒരുമിച്ച് ചേർക്കാം.മിശ്രണം ചെയ്യുമ്പോൾ വളരെ സൗമ്യത കാണിക്കരുത്, എല്ലാ സൂപ്പർനാറ്റന്റുകളും നീക്കം ചെയ്യാൻ ശ്രമിക്കരുത്.

2. 70-80% എത്തനോൾ ഉപയോഗിച്ച് കഴുകുക: കഴുകുമ്പോൾ, ശേഷിക്കുന്ന ഉപ്പ് കഴുകി കളയുന്നുവെന്ന് ഉറപ്പാക്കാൻ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് സസ്പെൻഡ് ചെയ്യണം.അതേ സമയം, എത്തനോൾ ഒഴിച്ചതിന് ശേഷം, കുറച്ച് സെക്കൻഡ് നേരത്തേക്ക് ഉയർന്ന വേഗതയിൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുക, തുടർന്ന് ഒരു പൈപ്പറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ശേഷിക്കുന്ന എത്തനോൾ നീക്കം ചെയ്യുക.5-10 മിനിറ്റ് ഊഷ്മാവിൽ നിന്ന ശേഷം പിരിച്ചുവിടുക.

11. പ്രത്യേക സംഘടനകളുടെ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ

1. നാരുകളുള്ള ടിഷ്യു: ഹൃദയം/എല്ലിൻറെ പേശികൾ പോലുള്ള നാരുകളുള്ള ടിഷ്യൂകളിൽ നിന്ന് ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിനുള്ള താക്കോൽ ടിഷ്യുവിനെ പൂർണ്ണമായും തടസ്സപ്പെടുത്തുക എന്നതാണ്.ഈ ടിഷ്യൂകൾക്ക് സെൽ സാന്ദ്രത കുറവാണ്, അതിനാൽ ടിഷ്യുവിന്റെ യൂണിറ്റ് ഭാരത്തിന് ആർഎൻഎയുടെ അളവ് കുറവാണ്, കഴിയുന്നത്ര പ്രാരംഭ തുക ഉപയോഗിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.മരവിപ്പിക്കുന്ന അവസ്ഥയിൽ ടിഷ്യു നന്നായി പൊടിക്കുന്നത് ഉറപ്പാക്കുക.

2. ഉയർന്ന പ്രോട്ടീൻ/കൊഴുപ്പ് അടങ്ങിയ ടിഷ്യുകൾ: മസ്തിഷ്കം/പച്ചക്കറി കൊഴുപ്പ് കൂടുതലാണ്.പിസിഐ വേർതിരിച്ചെടുത്ത ശേഷം, സൂപ്പർനാറ്റന്റിൽ വെളുത്ത ഫ്ലോക്കുളുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.സൂപ്പർനാറ്റന്റ് ക്ലോറോഫോം ഉപയോഗിച്ച് വീണ്ടും വേർതിരിച്ചെടുക്കണം.

3. ഉയർന്ന ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ്/റൈബോസൈം ഉള്ളടക്കമുള്ള ടിഷ്യുകൾ: പ്ലീഹ/തൈമസിൽ ഉയർന്ന ന്യൂക്ലിക് ആസിഡും റൈബോസൈം ഉള്ളടക്കവും ഉണ്ട്.തണുത്തുറഞ്ഞ അവസ്ഥയിൽ ടിഷ്യു പൊടിക്കുന്നത്, ദ്രുതഗതിയിലുള്ള ഹോമോജനൈസേഷനും റൈബോസൈമുകളെ ഫലപ്രദമായി നിർജ്ജീവമാക്കും.എന്നിരുന്നാലും, ലൈസേറ്റ് വളരെ വിസ്കോസ് ആണെങ്കിൽ (ഉയർന്ന ന്യൂക്ലിക് ആസിഡിന്റെ ഉള്ളടക്കം കാരണം), പിസിഐ വേർതിരിച്ചെടുക്കലിന് ഫലപ്രദമായി സ്ട്രാറ്റൈഫൈ ചെയ്യാൻ കഴിയില്ല;കൂടുതൽ ലൈസേറ്റ് ചേർത്താൽ ഈ പ്രശ്നം പരിഹരിക്കാം.ഒന്നിലധികം പിസിഐ എക്‌സ്‌ട്രാക്‌ഷനുകൾക്ക് കൂടുതൽ ശേഷിക്കുന്ന ഡിഎൻഎ നീക്കം ചെയ്യാൻ കഴിയും.ആൽക്കഹോൾ ചേർത്ത ഉടനെ ഒരു വെളുത്ത അവശിഷ്ടം രൂപപ്പെട്ടാൽ, അത് ഡിഎൻഎ മലിനീകരണത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.പിരിച്ചുവിട്ട ശേഷം അസിഡിറ്റി ഉള്ള പിസിഐ ഉപയോഗിച്ച് വീണ്ടും വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നത് ഡിഎൻഎ മലിനീകരണം നീക്കം ചെയ്യും.

4. പ്ലാന്റ് ടിഷ്യു: സസ്യകലകൾ മൃഗകലകളേക്കാൾ സങ്കീർണ്ണമാണ്.സാധാരണയായി, സസ്യങ്ങൾ ദ്രാവക നൈട്രജൻ അവസ്ഥയിൽ നിലത്തുകിടക്കുന്നു, അതിനാൽ എൻഡോജെനസ് എൻസൈമുകൾ വഴി ആർഎൻഎ നശിക്കുന്നത് അസാധാരണമാണ്.ഡീഗ്രേഡേഷൻ പ്രശ്നം പരിഹരിച്ചില്ലെങ്കിൽ, അത് സാമ്പിളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന മാലിന്യങ്ങൾ മൂലമാണ് സംഭവിക്കുന്നത്.പല സസ്യങ്ങളിലും അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന മാലിന്യങ്ങൾ അവശിഷ്ടങ്ങളിലേക്ക് നയിക്കും, അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഉണ്ടാകാനുള്ള കാരണം പലപ്പോഴും ഈ മാലിന്യങ്ങൾക്ക് ആർഎൻഎയുമായി ചില സാമ്യതകൾ ഉള്ളതുകൊണ്ടാണ്: നിങ്ങൾ അവശിഷ്ടമാക്കുന്നു, ഞാൻ അവശിഷ്ടമാക്കുന്നു, നിങ്ങൾ ആഗിരണം ചെയ്യുന്നു, ഞാൻ ആഗിരണം ചെയ്യുന്നു.ഈ സ്വഭാവസവിശേഷതകൾ അവ വളരെ ശക്തമായ എൻസൈം ഇൻഹിബിറ്ററുകളാണെന്ന് നിർണ്ണയിക്കുന്നു.

നിലവിൽ, വാണിജ്യ ആർ‌എൻ‌എ എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷൻ റിയാഗന്റുകൾ ചെറിയ ക്രമീകരണങ്ങളോടെ മിക്കവാറും എല്ലാ മൃഗകലകളിലേക്കും പൊരുത്തപ്പെടുത്താൻ കഴിയും, എന്നാൽ മിക്ക പ്ലാന്റ് ടിഷ്യൂകൾക്കും അനുയോജ്യമായ വാണിജ്യപരമായ ആർ‌എൻ‌എ എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷൻ റിയാക്ടറുകൾ കുറവാണ്.ഭാഗ്യവശാൽ, Foregene പ്രത്യേകം നൽകാൻ കഴിയുംപ്ലാന്റ് ആർഎൻഎ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ കിറ്റുകൾ, നമുക്ക് ഉണ്ട്പ്ലാന്റ് ടോട്ടൽ ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ്, പ്ലാന്റ് ടോട്ടൽ RNA ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ് പ്ലസ്.രണ്ടാമത്തേത് ഉയർന്ന പോളിസാക്രറൈഡും പോളിഫെനോളും ഉള്ള സസ്യങ്ങൾക്കായി പ്രത്യേകം രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിട്ടുള്ളതാണ്.ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിന്, ലാബ് ഉപയോക്താക്കളിൽ നിന്നുള്ള ഫീഡ്ബാക്ക് പ്രത്യേകിച്ചും നല്ലതാണ്.

12. സാമ്പിൾ മരവിപ്പിക്കലിന്റെയും ഉരുകലിന്റെയും ഫലം ശീതീകരിച്ച സാമ്പിൾ വലുതായിരിക്കാം, ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് അത് മുറിക്കേണ്ടതുണ്ട്.കട്ടിംഗ് സമയത്ത് സാമ്പിളുകൾ ഉരുകിപ്പോകും (ഒരുപക്ഷേ ഭാഗികമായി).ശീതീകരിച്ച സാമ്പിളുകൾ ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിന് മുമ്പ് തൂക്കിനോക്കേണ്ടതുണ്ട്, ഈ പ്രക്രിയയിൽ ഉരുകൽ തീർച്ചയായും സംഭവിക്കും.ചിലപ്പോൾ, ദ്രാവക നൈട്രജൻ മില്ലിംഗ് പ്രക്രിയയിൽ സാമ്പിൾ ഉരുകുന്നത് സംഭവിക്കുന്നു;അല്ലെങ്കിൽ ശീതീകരിച്ച സാമ്പിൾ ലിക്വിഡ് നൈട്രജൻ മില്ലിംഗ് ഇല്ലാതെ ലൈസേറ്റിലേക്ക് നേരിട്ട് ചേർക്കുന്നു, പൂർണ്ണമായ ഏകീകരണത്തിന് മുമ്പ് ഉരുകുന്നത് തീർച്ചയായും സംഭവിക്കും.ശീതീകരിച്ച ടിഷ്യൂകൾ പുതിയ ടിഷ്യുവിനെ അപേക്ഷിച്ച് ഉരുകുന്ന സമയത്ത് ആർഎൻഎ നശീകരണത്തിന് കൂടുതൽ സാധ്യതയുണ്ടെന്ന് പരീക്ഷണങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്.സാധ്യതയുള്ള കാരണം: ഫ്രീസ്-ഥോ പ്രക്രിയ കോശത്തിനുള്ളിലെ ഘടനകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു, ഇത് എൻഡോജെനസ് എൻസൈമുകൾക്ക് ആർഎൻഎയുമായി നേരിട്ട് സമ്പർക്കം പുലർത്തുന്നത് എളുപ്പമാക്കുന്നു.

13. ആർഎൻഎ ഗുണമേന്മയുടെ വിധി സാധാരണയായി, ആർഎൻഎയുടെ സമഗ്രത വിലയിരുത്താൻ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ ആർഎൻഎയുടെ പരിശുദ്ധി വിലയിരുത്താൻ എ260/എ280 ഉപയോഗിക്കുന്നു.സിദ്ധാന്തത്തിൽ, കേടുകൂടാത്ത RNA-യ്ക്ക് 28S:18S = 2.7:1 എന്ന അനുപാതമുണ്ട്, കൂടാതെ മിക്ക ഡാറ്റയും 28S:18S = 2:1 എന്ന അനുപാതത്തെ ഊന്നിപ്പറയുന്നു.കോശങ്ങൾ ഒഴികെയുള്ള സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഏതാണ്ട് ആർഎൻഎയൊന്നും 2:1 അനുപാതത്തിലല്ല എന്നതാണ് വസ്തുത (ഇത് എജിലന്റ് ബയോഅനലൈസർ ഉപയോഗിച്ചാണ് ലഭിച്ചത്).

ദ്വിതീയ ഘടന, ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് അവസ്ഥകൾ, സാമ്പിൾ ലോഡ്, EB യുടെ സാച്ചുറേഷൻ ഡിഗ്രി മുതലായവ ഉൾപ്പെടെ നിരവധി ഘടകങ്ങളാൽ RNA-യുടെ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ഫലങ്ങൾ ബാധിക്കുന്നു. RNA കണ്ടുപിടിക്കുന്നതിനും DNA മാർക്കർ ഒരു നിയന്ത്രണമായി ഉപയോഗിക്കുന്നതിനും നേറ്റീവ് ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ഉപയോഗിക്കുക.2kb-ലെ 28S ഉം 0.9kb-യിലെ 18S ഉം വ്യക്തവും 28S: 18S > 1 ഉം ആണെങ്കിൽ, സമഗ്രതയ്ക്ക് തുടർന്നുള്ള മിക്ക പരീക്ഷണങ്ങളുടെയും ആവശ്യകതകൾ നിറവേറ്റാനാകും.

A260/A280 എന്നത് വളരെയധികം ആശയക്കുഴപ്പം സൃഷ്ടിച്ച ഒരു സൂചകമാണ്.ഒന്നാമതായി, ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾക്കുള്ള ഈ സൂചകത്തിന്റെ യഥാർത്ഥ അർത്ഥം വ്യക്തമാക്കേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്: ശുദ്ധമായ RNA, അതിന്റെ A260/280 = ഏകദേശം 2.0.ശുദ്ധമായ RNA ആണ് 'കാരണം', A260/A280 = 2 'ഫലം' ആണ്.“A260/A280 = 2 ആണെങ്കിൽ RNA ശുദ്ധമാണ്” എന്ന് കരുതി ഇപ്പോൾ എല്ലാവരും A260/A280 ഒരു 'കാരണം' ആയി ഉപയോഗിക്കുന്നു, ഇത് സ്വാഭാവികമായും ആശയക്കുഴപ്പത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു.

നിങ്ങൾക്ക് താൽപ്പര്യമുണ്ടെങ്കിൽ, നിങ്ങളുടെ ആർഎൻഎ സാമ്പിളിലേക്ക് ഫിനോൾ, ഗ്വാനിഡിൻ ഐസോത്തിയോസയനേറ്റ്, പിഇജി മുതലായവ പോലുള്ള വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു ചെറിയ റിയാജന്റ് ചേർക്കാം, തുടർന്ന് A260/A280 അനുപാതം അളക്കുക.RNA വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന പല റിയാക്ടറുകളും സാമ്പിളിലെ പല മാലിന്യങ്ങളും ഏകദേശം A260, A280 എന്നിവ ആഗിരണം ചെയ്യുന്നു, ഇത് A260/A280-നെ ബാധിക്കുന്നു എന്നതാണ് യാഥാർത്ഥ്യം.

200-300 nm റേഞ്ചിലുള്ള RNA സാമ്പിളുകൾ സ്കാൻ ചെയ്യുക എന്നതാണ് ഇപ്പോഴത്തെ ഏറ്റവും പ്രബോധനപരമായ സമീപനം.ശുദ്ധമായ RNA-യുടെ വക്രത്തിന് ഇനിപ്പറയുന്ന സ്വഭാവസവിശേഷതകൾ ഉണ്ട്: വക്രം മിനുസമാർന്നതാണ്, A230, A260 എന്നിവ രണ്ട് ഇൻഫ്‌ളക്ഷൻ പോയിന്റുകളാണ്, A300 0-ന് അടുത്താണ്, A260/A280 = ഏകദേശം 2.0, A260/A230 = ഏകദേശം 2.0.സ്കാൻ ഡാറ്റ ലഭ്യമല്ലെങ്കിൽ, A260/A230 അനുപാതവും നിർണ്ണയിക്കേണ്ടതുണ്ട്, കാരണം ഈ അനുപാതം എൻസൈമാറ്റിക് പ്രതിപ്രവർത്തനത്തെ ബാധിക്കുന്ന എല്ലാ മാലിന്യങ്ങളും കൊണ്ടുപോകുന്നതിന് കൂടുതൽ സെൻസിറ്റീവ് ആണ്.ഉപകരണത്തിന്റെ രേഖീയ ശ്രേണി (A260-ന് 0.1-0.5) കണക്കിലെടുക്കുക.

മറ്റ് രണ്ട് ഉപയോഗപ്രദമായ പ്രതിഭാസങ്ങളുണ്ട്: A260/A280 വെള്ളത്തിൽ അളക്കുമ്പോൾ അനുപാതം 0.3 കുറവായിരിക്കും;10 എംഎം ഇഡിടിഎയിൽ അളക്കുന്ന അനുപാതം 1 എംഎം ഇഡിടിഎയിൽ അളക്കുന്നതിനേക്കാൾ 0.2 കൂടുതലാണ്.

ബന്ധപ്പെട്ട ഉല്പന്നങ്ങൾ:

ചൈന പ്ലാന്റ് ടോട്ടൽ RNA ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ് നിർമ്മാതാവും വിതരണക്കാരനും |ഫോർജീൻ (foreivd.com)

ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷൻ സീരീസ് വിതരണക്കാരും ഫാക്ടറിയും |ചൈന RNA ഐസൊലേഷൻ സീരീസ് നിർമ്മാതാക്കൾ (foreivd.com)

ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷൻ സീരീസ് - ഫോർജീൻ കോ., ലിമിറ്റഡ് (foreivd.com)