കോളം പ്ലഗ് ചെയ്തു

കോളം പ്ലഗ് ചെയ്‌ത ശേഷം, ആർഎൻഎ വിളവ് കുറയുന്നു അല്ലെങ്കിൽ ആർഎൻഎ ശുദ്ധീകരിക്കുന്നത് അസാധ്യമാണ്, കൂടാതെ ലഭിച്ച ആർഎൻഎ പിണ്ഡം കുറവാണ്.

സാധാരണ കാരണ വിശകലനം:

1. സാമ്പിൾ ബ്രേക്കുകൾ സമഗ്രമല്ല.

സാമ്പിൾ പൊട്ടൽ DNA-ക്ലീനിംഗ് കോളം പൂർണ്ണമായും തടയുന്നതിന് കാരണമാകില്ല, അതേസമയം RNA വിളവിനെയും ഗുണനിലവാരത്തെയും ബാധിക്കുന്നു.നിങ്ങൾ സാമ്പിളുകൾ തകർക്കുമ്പോൾ ആവശ്യത്തിന് ലിക്വിഡ് നൈട്രജൻ ഉപയോഗിച്ച് ദ്രുതഗതിയിലുള്ള ഗ്രൈൻഡിംഗ് ഓപ്പറേഷൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു, സാമ്പിൾ സെൽ മതിൽ, സെൽ മെംബ്രൺ, മറ്റ് ടിഷ്യു എന്നിവ തകർക്കാൻ ശ്രമിക്കുക.പോളിയോൾ പോളിസാക്രറൈഡുകളുടെ സസ്യ സാമ്പിളുകൾക്കായി, നിങ്ങൾ പ്ലാന്റ് ടോട്ടൽ ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ് പ്ലസ് ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

2. ഡിഎൻഎ-ക്ലീനിംഗ് കോളം ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ച സാമ്പിൾ സൂപ്പർനാറ്റന്റ് വലിച്ചെടുക്കുമ്പോൾ, സാധ്യമായ സെൽ വിഘടിച്ച അവശിഷ്ടം ശ്വസിച്ചേക്കാം.

സെൽ വിഘടിച്ച അവശിഷ്ടങ്ങൾ ആർഎൻഎ-മാത്രം കോളത്തിന് കാരണമാകും, അത് ആർഎൻഎ അഡോർപ്ഷൻ ഓപ്പറേഷൻ നടത്തുമ്പോൾ തടയപ്പെടും (ഘട്ടം 6 കാണുക).കോശ അവശിഷ്ടങ്ങൾ വലിച്ചെടുക്കുന്നത് ഒഴിവാക്കാൻ ഈ സൂപ്പർനാറ്റന്റ് വലിച്ചെടുക്കുമ്പോൾ ശ്രദ്ധാപൂർവം ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

3. സാമ്പിൾ പ്രാരംഭ തുക വളരെ കൂടുതലാണ്.

അമിതമായ സാമ്പിൾ ഉപയോഗം, ബഫർ PSL1 വഴി അപൂർണ്ണമായ സാമ്പിൾ വിഘടനത്തിനോ അപൂർണ്ണമായ സെൽ ലിസിസിനോ കാരണമാകും, ഇത് ശുദ്ധീകരണ സമയത്ത് ശുദ്ധീകരണ കോളം തടസ്സപ്പെടുന്നതിന് കാരണമാകും.പ്ലാന്റ് ടോട്ടൽ ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ് ഓരോ ശുദ്ധീകരിച്ച പ്രവർത്തന സാമ്പിളും 50 മില്ലിഗ്രാം ആണ്.പോളിയോൾ പോളിസാക്രറൈഡുകളുടെ സസ്യ സാമ്പിളുകൾക്കായി, നിങ്ങൾ പ്ലാന്റ് ടോട്ടൽ ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ് പ്ലസ് പരീക്ഷിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

4. സെൻട്രിഫ്യൂജിന്റെ താപനില വളരെ കുറവാണ്.

മുഴുവൻ ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷനും ശുദ്ധീകരണ പ്രക്രിയയും ഊഷ്മാവിൽ (20-25) നടക്കുന്നു°സി), ലിക്വിഡ് നൈട്രജൻ ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിൾ ടിഷ്യു തകരുന്നു എന്നതൊഴിച്ചാൽ. ചില ക്രയോജനിക് സെൻട്രിഫ്യൂജുകളുടെ താപനില 20-ൽ താഴെയാണ്.℃, ഇത് ഡിഎൻഎ-ക്ലീനിംഗ് കോളം കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ ആർഎൻഎ-മാത്രം കോളം തടയുന്നതിന് കാരണമായേക്കാം.ഇത് സംഭവിക്കുകയാണെങ്കിൽ, സെൻട്രിഫ്യൂജ് താപനില 20-25 ആയി സജ്ജമാക്കുക℃, ഒപ്പംലിസിസ് മിശ്രിതം കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ എത്തനോൾ ചേർത്ത സൂപ്പർനാറ്റന്റ് 37 വരെ ചൂടാക്കിയെന്ന് ഉറപ്പാക്കുക°C.

ആർഎൻഎ എക്‌സ്‌ട്രാക്‌റ്റുചെയ്യാത്തതോ ആർഎൻഎ വിളവ് കുറവോ അല്ല

വീണ്ടെടുക്കൽ കാര്യക്ഷമതയെ ബാധിക്കുന്ന നിരവധി ഘടകങ്ങളുണ്ട്, ഉദാഹരണത്തിന്: സാമ്പിൾ ആർഎൻഎ ഉള്ളടക്കം, പ്രവർത്തന രീതി, എല്യൂഷൻ വോളിയം മുതലായവ.

പൊതുവായ കാരണങ്ങളുടെ വിശകലനം ചുവടെ:

1.ഓപ്പറേഷൻ സമയത്ത് ഒരു ഐസ് ബാത്ത് അല്ലെങ്കിൽ താഴ്ന്ന താപനില (4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ്) സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ നടത്തി.

നിർദ്ദേശം: ഊഷ്മാവിൽ പ്രവർത്തിക്കുക (15-25°സി) മുഴുവൻ പ്രക്രിയയിലും, ഐസ് ബാത്ത്, താഴ്ന്ന താപനില സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ എന്നിവ ചെയ്യരുത്.

2.സാമ്പിളിന്റെ അനുചിതമായ സംരക്ഷണം അല്ലെങ്കിൽ സാമ്പിളിന്റെ ദീർഘകാല സംരക്ഷണം കാരണം ആർ.എൻ.എ.

ശുപാർശ: പുതുതായി ശേഖരിച്ച സാമ്പിളുകൾ ദ്രാവക നൈട്രജനിൽ വേഗത്തിൽ ഫ്രീസുചെയ്യണം, തുടർന്ന് -80 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ വളരെക്കാലം സൂക്ഷിക്കണം, സാമ്പിളുകൾ ആവർത്തിച്ച് മരവിപ്പിക്കലും ഉരുകലും ഒഴിവാക്കുക;അല്ലെങ്കിൽ ഉടൻ തന്നെ സാമ്പിളുകൾ RNA സ്റ്റെബിലൈസർ RNAlater ലായനിയിൽ (മൃഗങ്ങളുടെ സാമ്പിളുകൾ) മുക്കിവയ്ക്കുക.

3.അപര്യാപ്തമായ സാമ്പിൾ ഫ്രാഗ്മെന്റേഷനും ലിസിസും ശുദ്ധീകരണ നിരയുടെ തടസ്സത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു.

നിർദ്ദേശം: ടിഷ്യു പൊടിക്കുമ്പോൾ, ടിഷ്യു വേണ്ടത്ര പൊടിച്ചിട്ടുണ്ടെന്ന് ഉറപ്പാക്കുക, അത് മുൻകൂട്ടി തയ്യാറാക്കിയ ബഫർ PSL1-ലേക്ക് വേഗത്തിൽ മാറ്റുക (β-ME യുടെ ശരിയായ അനുപാതം ചേർത്തിട്ടുണ്ടെന്ന് സ്ഥിരീകരിക്കുക, നടപടിക്രമത്തിന്റെ ഘട്ടം 1 കാണുക).

4.എല്യൂന്റ് തെറ്റായി ചേർത്തു.

നിർദ്ദേശം: RNase-Free ddH2O പ്യൂരിഫിക്കേഷൻ കോളം മെംബ്രണിന്റെ നടുവിലേക്ക് ഡ്രിപ്പ് ചെയ്തിട്ടുണ്ടെന്ന് ഉറപ്പാക്കുക.

5. ബഫർ പിഎസ്എൽ2 അല്ലെങ്കിൽ ബഫർ പിആർഡബ്ല്യു2 എന്നിവയിൽ കേവല എത്തനോളിന്റെ ശരിയായ അളവ് ചേർത്തിട്ടില്ല.

നിർദ്ദേശം: ദയവായി നിർദ്ദേശങ്ങൾ പാലിക്കുക, ബഫർ PSL2, Buffer PRW2 എന്നിവയിലേക്ക് സമ്പൂർണ്ണ എത്തനോളിന്റെ ശരിയായ അളവ് ചേർക്കുകയും കിറ്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് നന്നായി ഇളക്കുക.

6. ടിഷ്യു സാമ്പിളിന്റെ അളവ് അനുചിതമാണ്.

നിർദ്ദേശം: 500 μl ബഫർ PSL1 ന് 50 mg ടിഷ്യു ഉപയോഗിക്കുക.വളരെയധികം ടിഷ്യു ഉപയോഗിക്കുന്നത് ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിന്റെ അളവ് കുറയ്ക്കുകയും തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ആർഎൻഎയുടെ പരിശുദ്ധിയും കുറയുകയും ചെയ്യും.പ്രാരംഭ സാമ്പിൾ ഡോസ് ഓരോ RNA എക്സ്ട്രാക്ഷൻ ഓപ്പറേഷനും 50 mg കവിയാൻ പാടില്ല എന്ന് ഞങ്ങൾ ശക്തമായി ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

7.അനുചിതമായ എല്യൂഷൻ വോളിയം അല്ലെങ്കിൽ അപൂർണ്ണമായ എല്യൂഷൻ.

നിർദ്ദേശം: ശുദ്ധീകരണ നിരയുടെ എല്യൂന്റ് വോളിയം 50-200 μl ആണ്;എല്യൂഷൻ ഇഫക്റ്റ് തൃപ്തികരമല്ലെങ്കിൽ, 5-10മിനിറ്റ് പോലെ, പ്രീഹീറ്റ് ചെയ്ത RNase-Free ddH2O ചേർത്ത ശേഷം ഊഷ്മാവിൽ സമയം നീട്ടാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

8. BufferPRW2 ഉപയോഗിച്ച് കഴുകിയ ശേഷം ശുദ്ധീകരണ കോളത്തിൽ എത്തനോൾ അവശിഷ്ടം ഉണ്ട്.

നിർദ്ദേശം: ശൂന്യമായ ട്യൂബ് 1 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും ബഫർ PRW2-ൽ കഴുകിയതിന് ശേഷവും എത്തനോൾ ശേഷിക്കുകയും ചെയ്താൽ, നിങ്ങൾക്ക് ശൂന്യമായ ട്യൂബ് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ സമയം 2 മിനിറ്റായി വർദ്ധിപ്പിക്കാം, അല്ലെങ്കിൽ ശേഷിക്കുന്ന എത്തനോൾ പൂർണ്ണമായി നീക്കം ചെയ്യാൻ 5 മിനിറ്റ് ഊഷ്മാവിൽ ശുദ്ധീകരണ കോളം സ്ഥാപിക്കുക.

9.കിറ്റ് തെറ്റായി ഉപയോഗിച്ചു.

നിർദ്ദേശം: പോളിഫെനോളിക് പോളിസാക്രറൈഡുകളുടെ സസ്യ സാമ്പിളുകൾക്ക്, പ്ലാന്റ് ടോട്ടൽ ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ് പോലുള്ള സാധാരണ കിറ്റുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നത് അനുയോജ്യമായ ആർഎൻഎ സാമ്പിളുകൾ ലഭിക്കണമെന്നില്ല.പോളിഫിനോളിക് പോളിസാക്രറൈഡ് പ്ലാന്റ് സാമ്പിളുകൾക്കായി പ്രത്യേകം രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത പ്ലാന്റ് ടോട്ടൽ ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷൻകിറ്റ് പ്ലസ് ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.പോളിഫിനോൾ, പോളിസാക്രറൈഡ് പ്ലാന്റ് സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ പ്രത്യേകം വികസിപ്പിച്ചെടുത്ത കിറ്റ്.

OD260/OD280 മൂല്യം കുറവാണ്

ddH2O ഉള്ള ആർഎൻഎ എല്യൂഷൻ, സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ റീഡിംഗുകൾക്കായി ഉപയോഗിക്കുന്നത് കുറഞ്ഞ OD260/OD280 മൂല്യങ്ങൾക്ക് കാരണമാകുന്നു.താരതമ്യേന ശരിയായ OD260/OD280 മൂല്യങ്ങൾ ലഭിക്കുന്നതിന്, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 (ആർഎൻഎയെ ഒഴിവാക്കുന്നതിന് RNase-Free ddH2O എന്നതിന് പകരം) ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു, പേജ് 19-ലെ "RNA കോൺസൺട്രേഷനും ശുദ്ധീകരണ പരിശോധനകളും" കാണുക.

ശുദ്ധീകരിക്കപ്പെട്ട ആർ.എൻ.എ

ശുദ്ധീകരിച്ച RNA യുടെ ഗുണനിലവാരം സാമ്പിൾ സംരക്ഷണം, RNase മലിനീകരണം, കൃത്രിമത്വം തുടങ്ങിയ ഘടകങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.

സാധാരണ കാരണങ്ങളുടെ വിശകലനം:

1. ശേഖരണത്തിന് ശേഷം ടിഷ്യു സാമ്പിളുകൾ കൃത്യസമയത്ത് സംഭരിച്ചിട്ടില്ല.

ശുപാർശ: ശേഖരണത്തിന് ശേഷം ടിഷ്യു സാമ്പിളുകൾ യഥാസമയം ഉപയോഗിച്ചില്ലെങ്കിൽ, ദയവായി അവയെ താഴ്ന്ന ഊഷ്മാവിൽ ലിക്വിഡ് നൈട്രജനിൽ ഉടനടി സംഭരിക്കുക അല്ലെങ്കിൽ ദ്രാവക നൈട്രജനിൽ പെട്ടെന്ന് മരവിപ്പിച്ചതിന് ശേഷം ദീർഘകാല സംഭരണത്തിനായി -80 ° C ലേക്ക് മാറ്റുക, അല്ലെങ്കിൽ സാമ്പിളുകൾ RNA സ്റ്റെബിലൈസർ RNA ലേറ്റർ ലായനിയിൽ (മൃഗങ്ങളുടെ സാമ്പിളുകൾ) മുക്കിവയ്ക്കുക.ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ, പുതുതായി ശേഖരിച്ച ടിഷ്യു സാമ്പിളുകൾ ഉപയോഗിക്കാൻ ശ്രമിക്കുക.

2. ടിഷ്യൂ സാമ്പിളുകളുടെ ആവർത്തിച്ചുള്ള മരവിപ്പിക്കലും ഉരുകലും.

നിർദ്ദേശം: ടിഷ്യൂ സാമ്പിളുകൾ സൂക്ഷിക്കുമ്പോൾ, അവയെ സംരക്ഷിക്കുന്നതിനായി ചെറിയ കഷണങ്ങളാക്കി മുറിച്ച്, സാമ്പിളുകൾ ആവർത്തിച്ചുള്ള മരവിപ്പിക്കലും ഉരുകലും മൂലമുണ്ടാകുന്ന ആർ‌എൻ‌എയുടെ അപചയം ഒഴിവാക്കാൻ അവ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ അവയുടെ ഒരു ഭാഗം പുറത്തെടുക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.

3.RNase ഓപ്പറേഷൻ റൂമിൽ അവതരിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു അല്ലെങ്കിൽ ഡിസ്പോസിബിൾ കയ്യുറകൾ, മാസ്കുകൾ മുതലായവ ധരിക്കരുത്.

നിർദ്ദേശം: ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ പരീക്ഷണങ്ങൾ പ്രത്യേക ആർഎൻഎ പ്രവർത്തനങ്ങളിലാണ് ഏറ്റവും മികച്ചത്, പരീക്ഷണത്തിന് മുമ്പ് ലബോറട്ടറി ടേബിൾ വൃത്തിയാക്കണം, കൂടാതെ ആർ‌എൻ‌എസിന്റെ ആമുഖം മൂലമുണ്ടാകുന്ന ആർ‌എൻ‌എ അപചയം പരമാവധി ഒഴിവാക്കുന്നതിന് പരീക്ഷണ സമയത്ത് ഡിസ്പോസിബിൾ ഗ്ലൗസും മാസ്കുകളും ധരിക്കണം.

4.ഉപയോഗ സമയത്ത് RNase മുഖേന റിയാജൻറ് മലിനീകരിക്കപ്പെടുന്നു.

നിർദ്ദേശം: അനുബന്ധ പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി സസ്യങ്ങളുടെ മൊത്തം RNA വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ കിറ്റുകളുടെ ഒരു പുതിയ ശ്രേണി ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുക.

5.ആർഎൻഎ കൃത്രിമത്വത്തിന് ഉപയോഗിക്കുന്ന സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബുകളും പൈപ്പറ്റ് ടിപ്പുകളും RNase കൊണ്ട് മലിനമാണ്.

നിർദ്ദേശം: ആർഎൻഎ എക്‌സ്‌ട്രാക്‌ഷനിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബുകൾ, പൈപ്പറ്റ് നുറുങ്ങുകൾ, പൈപ്പറ്റുകൾ തുടങ്ങിയവയെല്ലാം RNase-ഫ്രീ ആണെന്ന് ഉറപ്പാക്കുക.

ഇൻസ്ട്രക്ഷൻ മാനുവലുകൾ:

പ്ലാന്റ് ടോട്ടൽ RNA ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ് പ്ലസ് ഇൻസ്ട്രക്ഷൻ മാനുവൽ