1. പ്രാരംഭ ധാരണ

ഈ ഘട്ടത്തിൽ, നമ്മുടെ മുതിർന്നവരുടെ മുന്നിൽ തെറ്റുകൾ വരുത്താതിരിക്കാൻ, ചില ആശയങ്ങളും പദാവലികളും നമ്മൾ മനസ്സിലാക്കേണ്ടതുണ്ട്:

ചോദ്യം: RT-PCR, qPCR, റിയൽ-ടൈം PCR, തത്സമയ RT-PCR എന്നിവ തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസം എന്താണ്?

ഉത്തരം: RT-PCR റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ PCR ആണ്(റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പിസിആർ, ആർടി-പിസിആർ), ഇത് പോളിമറേസ് ചെയിൻ റിയാക്ഷന്റെ (പിസിആർ) വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു വകഭേദമാണ്.RT-PCR-ൽ, ഒരു RNA സ്‌ട്രാൻഡ് കോംപ്ലിമെന്ററി ഡിഎൻഎയിലേക്ക് റിവേഴ്‌സ് ട്രാൻസ്‌ക്രൈബ് ചെയ്യപ്പെടുന്നു, അത് പിന്നീട് പിസിആർ വഴി ഡിഎൻഎ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.
തത്സമയ-PCR, qPCR എന്നിവ(Quantitative Rea-ltime-PCR) ഒന്നുതന്നെയാണ്, രണ്ടും തത്സമയ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR ആണ്, അതായത് PCR-ന്റെ ഓരോ സൈക്കിളിനും തത്സമയ ഡാറ്റാ റെക്കോർഡുകൾ ഉണ്ട്, അതിനാൽ ആരംഭിക്കുന്ന ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെ എണ്ണം കൃത്യമായ വിശകലനം ക്രമീകരിക്കാൻ കഴിയും.

റിയൽ-ടൈം പിസിആർ (റിയൽ-ടൈം ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ), റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പിസിആർ (റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പിസിആർ) എന്നിവ RT-PCR എന്ന് ചുരുക്കി പറയുന്നതായി തോന്നുമെങ്കിലും, അന്താരാഷ്ട്ര കൺവെൻഷൻ ഇതാണ്: RT-PCR പ്രത്യേകമായി റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.PCR , റിയൽ-ടൈം PCR പൊതുവെ qPCR (ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് റിയൽ-ടൈം PCR) എന്ന് ചുരുക്കിയിരിക്കുന്നു..

തത്സമയ RT-PCR (RT-qPCR), ഇത് ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് സാങ്കേതികവിദ്യയുമായി സംയോജിപ്പിച്ച റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ PCR ആണ്.: ആദ്യം RNA റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനിൽ നിന്ന് cDNA (RT) നേടുക, തുടർന്ന് അളവ് വിശകലനത്തിനായി (qPCR) റിയൽ-ടൈം PCR ഉപയോഗിക്കുക.മിക്ക ലബോറട്ടറികളും RT-qPCR ചെയ്യുന്നു, അതായത്, RNA എക്‌സ്‌പ്രഷൻ ഡൗൺ-റെഗുലേഷനെക്കുറിച്ചുള്ള ഗവേഷണം, അതിനാൽ ലബോറട്ടറിയിൽ എല്ലാവരും സംസാരിക്കുന്ന qPCR യഥാർത്ഥത്തിൽ RT-qPCR-നെയാണ് സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, എന്നാൽ ക്ലിനിക്കൽ ആപ്ലിക്കേഷനുകളിൽ ഇപ്പോഴും നിരവധി ഡിഎൻഎ പരിശോധനകൾ ഉണ്ടെന്ന കാര്യം മറക്കരുത്.ഹെപ്പറ്റൈറ്റിസ് ബി വൈറസ് എച്ച്ബിവി കണ്ടെത്തൽ പോലുള്ള അളവ് വിശകലനം.

ചോദ്യം: ധാരാളം ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ വായിച്ചതിനുശേഷം, ആംപ്ലിഫൈഡ് ശകലം 80-300 ബിപി പരിധിക്കുള്ളിൽ നിയന്ത്രിക്കേണ്ടത് എന്തുകൊണ്ട്?

ഉത്തരം: ഓരോ ജീൻ സീക്വൻസിന്റെയും ദൈർഘ്യം വ്യത്യസ്തമാണ്, ചിലത് നിരവധി കെബിയാണ്, ചിലത് നൂറുകണക്കിന് ബിപിയാണ്, എന്നാൽ പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുമ്പോൾ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ ദൈർഘ്യം 80-300 ബിപി ആയിരിക്കണം, വളരെ ചെറുതോ വലുതോ ആയത് ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ കണ്ടെത്തലിന് അനുയോജ്യമല്ല.പ്രൈമർ-ഡൈമറിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചറിയാൻ ഉൽപ്പന്ന ശകലം വളരെ ചെറുതാണ്.പ്രൈമർ-ഡൈമറിന്റെ ദൈർഘ്യം ഏകദേശം 30-40 ബിപി ആണ്, ഇത് 80 ബിപിയിൽ കുറവാണെങ്കിൽ അത് പ്രൈമർ-ഡൈമറോ ഉൽപ്പന്നമോ എന്ന് വേർതിരിച്ചറിയാൻ പ്രയാസമാണ്.ഉൽപ്പന്ന ശകലം വളരെ ദൈർഘ്യമേറിയതാണെങ്കിൽ, 300bp കവിയുന്നുവെങ്കിൽ, അത് കുറഞ്ഞ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയിലേക്ക് നയിക്കുകയും ജീനിന്റെ അളവ് ഫലപ്രദമായി കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്യും.

ഉദാഹരണത്തിന്, ഒരു ക്ലാസ് മുറിയിൽ എത്ര പേരുണ്ടെന്ന് നിങ്ങൾ കണക്കാക്കുമ്പോൾ, എത്ര വായകളുണ്ടെന്ന് മാത്രം കണക്കാക്കേണ്ടതുണ്ട്.നിങ്ങൾ ജീനുകൾ കണ്ടെത്തുമ്പോൾ ഇത് ശരിയാണ്, മുഴുവൻ സീക്വൻസും പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നതിന് നിങ്ങൾ ഒരു ജീനിന്റെ ഒരു നിശ്ചിത ശ്രേണി മാത്രം കണ്ടെത്തേണ്ടതുണ്ട്.നിങ്ങൾക്ക് ആളുകളെ കണക്കാക്കണമെങ്കിൽ, നിങ്ങൾ വായയും മൂക്കും, ചെവിയും കണ്ണടയും എണ്ണേണ്ടതുണ്ട്, തെറ്റുകൾ വരുത്താൻ എളുപ്പമാണ്.

വിപുലീകരിക്കാൻ, ജൈവ ഗവേഷണത്തിൽ, പോയിന്റ് തോറും നിരവധി ഗവേഷണ കേസുകൾ ഉണ്ട്, കാരണം ഏതൊരു സ്പീഷിസിന്റെയും ജീൻ സീക്വൻസ് വളരെ ദൈർഘ്യമേറിയതാണ്, ബാക്ടീരിയ 16 എസ് സീക്വൻസിങ് പോലെയുള്ള എല്ലാ ശകലങ്ങളും അളക്കുന്നത് അനാവശ്യവും അസാധ്യവുമാണ്.

ചോദ്യം: qPCR പ്രൈമർ ഡിസൈനിനുള്ള ഒപ്റ്റിമൽ ദൈർഘ്യം എന്താണ്?

ഉത്തരം: പൊതുവായി പറഞ്ഞാൽ, പ്രൈമർ ദൈർഘ്യം ഏകദേശം 20-24bp ആണ്, ഇത് നല്ലതാണ്.തീർച്ചയായും, പ്രൈമർ രൂപകൽപന ചെയ്യുമ്പോൾ പ്രൈമറിന്റെ ടിഎം മൂല്യം നാം ശ്രദ്ധിക്കണം, കാരണം ഇത് ഒപ്റ്റിമൽ അനീലിംഗ് താപനിലയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടതാണ്.ഒരുപാട് പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക് ശേഷം, 60 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസാണ് മികച്ച ടിഎം മൂല്യമെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടു.അനീലിംഗ് താപനില വളരെ കുറവാണെങ്കിൽ, അത് എളുപ്പത്തിൽ നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷനിലേക്ക് നയിക്കും.അനീലിംഗ് താപനില വളരെ ഉയർന്നതാണെങ്കിൽ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത താരതമ്യേന കുറവായിരിക്കും, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വക്രത്തിന്റെ കൊടുമുടി പിന്നീട് ആരംഭിക്കും, കൂടാതെ CT മൂല്യം വൈകും.

ചോദ്യം: ഡൈ രീതി അന്വേഷണ രീതിയിൽ നിന്ന് എങ്ങനെ വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു?

ഉത്തരം: ഡൈ രീതിSYBR ഗ്രീൻ Ⅰ, PicoGreen, BEBO മുതലായ ചില ഫ്ലൂറസന്റ് ഡൈകൾ സ്വയം പ്രകാശം പുറപ്പെടുവിക്കുന്നില്ല, പക്ഷേ ഇരട്ട-ധാരയുള്ള DNA യുടെ മൈനർ ഗ്രോവിലേക്ക് ബന്ധിപ്പിച്ച ശേഷം ഫ്ലൂറസെൻസ് പുറപ്പെടുവിക്കും.അതിനാൽ, PCR പ്രതികരണത്തിന്റെ തുടക്കത്തിൽ, യന്ത്രത്തിന് ഫ്ലൂറസന്റ് സിഗ്നൽ കണ്ടുപിടിക്കാൻ കഴിയില്ല.പ്രതികരണം അനീലിംഗ്-എക്‌സ്റ്റൻഷൻ ഘട്ടത്തിൽ എത്തുമ്പോൾ, ഇരട്ട സ്‌ട്രാൻഡ് തുറക്കുകയും ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെ പ്രവർത്തനത്തിൽ ഒരു പുതിയ സ്‌ട്രാൻഡ് സമന്വയിപ്പിക്കുകയും ഫ്ലൂറസെന്റ് തന്മാത്ര dsDNA മൈനർ ഗ്രോവുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.പിസിആർ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം കൂടുന്നതിനനുസരിച്ച്, കൂടുതൽ കൂടുതൽ ഡൈകൾ ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎയുമായി സംയോജിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ ഫ്ലൂറസന്റ് സിഗ്നലും തുടർച്ചയായി മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നു.ഡൈ രീതി പ്രധാനമായും ശാസ്ത്രീയ ഗവേഷണങ്ങളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു.
PS: പരീക്ഷണം നടത്തുമ്പോൾ ശ്രദ്ധിക്കുക, ഡൈ മനുഷ്യന്റെ ഡിഎൻഎയുമായി സംയോജിപ്പിക്കണം, അത് ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് വ്യക്തിയായി മാറ്റാൻ ശ്രദ്ധിക്കുക.

ഡൈ രീതി (ഇടത്) പ്രോബ് രീതി (വലത്)
PS: പരീക്ഷണം നടത്തുമ്പോൾ ശ്രദ്ധിക്കുക, ഡൈ മനുഷ്യന്റെ ഡിഎൻഎയുമായി സംയോജിപ്പിക്കണം, അത് ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് വ്യക്തിയായി മാറ്റാൻ ശ്രദ്ധിക്കുക.

SYBR ഗ്രീൻ Ⅰ ഡിഎൻഎയുടെ മൈനർ ഗ്രോവിലേക്ക് ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു

അന്വേഷണ രീതിഏറ്റവും സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ജലവിശ്ലേഷണ പേടകമാണ് തക്മാൻ പേടകം.അന്വേഷണത്തിന്റെ 5′ അറ്റത്ത് ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പ് ഉണ്ട്, സാധാരണയായി FAM, കൂടാതെ അന്വേഷണം തന്നെ ടാർഗെറ്റ് ജീനുമായി പൂരകമായ ഒരു ശ്രേണിയാണ്.3′ അറ്റത്ത് ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വഞ്ചിംഗ് ഗ്രൂപ്പ് ഉണ്ട്.ഫ്ലൂറസെൻസ് റിസോണൻസ് എനർജി ട്രാൻസ്ഫർ (Förster resonance energy transfer, FRET) തത്വമനുസരിച്ച്, റിപ്പോർട്ടർ ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പും (ഡോണർ ഫ്ലൂറസെന്റ് മോളിക്യൂൾ) ക്വഞ്ചിംഗ് ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പും (അക്സെപ്റ്റർ ഫ്ലൂറസെന്റ് മോളിക്യൂൾ) ആവേശഭരിതമാകുമ്പോൾ, സ്പെക്ട്ര വളരെ അടുത്ത് വരുമ്പോൾ, 7 ദൂരം വർധിക്കുന്നു. സ്വീകാര്യമായ തന്മാത്രയുടെ ഫ്ലൂറസെൻസ്, ഓട്ടോഫ്ലൂറസെൻസ് ദുർബലമാകുമ്പോൾ.അതിനാൽ, പിസിആർ പ്രതികരണത്തിന്റെ തുടക്കത്തിൽ, അന്വേഷണം സ്വതന്ത്രവും സിസ്റ്റത്തിൽ കേടുകൂടാതെയുമിരിക്കുമ്പോൾ, റിപ്പോർട്ടർ ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പ് ഫ്ലൂറസെൻസ് പുറപ്പെടുവിക്കില്ല.അനീലിംഗ് ചെയ്യുമ്പോൾ, പ്രൈമറും പ്രോബും ടെംപ്ലേറ്റുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു.വിപുലീകരണ ഘട്ടത്തിൽ, പോളിമറേസ് തുടർച്ചയായി പുതിയ ശൃംഖലകളെ സമന്വയിപ്പിക്കുന്നു.ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന് 5′-3′ എക്സോന്യൂക്ലീസ് പ്രവർത്തനമുണ്ട്.അന്വേഷണത്തിൽ എത്തുമ്പോൾ, ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് ടെംപ്ലേറ്റിൽ നിന്ന് പ്രോബിനെ ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യും, റിപ്പോർട്ടർ ഫ്ലൂറസന്റ് ഗ്രൂപ്പിനെ ക്വഞ്ചർ ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പിൽ നിന്ന് വേർതിരിക്കുകയും ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നൽ പുറത്തുവിടുകയും ചെയ്യും.പേടകവും ടെംപ്ലേറ്റും തമ്മിൽ പരസ്പരം ബന്ധമുള്ളതിനാൽ, പരിശോധനയുടെ കൃത്യതയുടെയും സംവേദനക്ഷമതയുടെയും അടിസ്ഥാനത്തിൽ ഡൈ രീതിയേക്കാൾ പ്രോബ് രീതി മികച്ചതാണ്.പ്രോബ് രീതി പ്രധാനമായും രോഗനിർണയത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു.

ചോദ്യം: എന്താണ് കേവല അളവ്?എന്താണ് ആപേക്ഷിക അളവ്?

ഉത്തരം: 1ml രക്തത്തിൽ എത്ര HBV വൈറസുകൾ ഉണ്ട് എന്നതുപോലുള്ള qPCR പരിശോധിക്കേണ്ട സാമ്പിളിന്റെ പ്രാരംഭ കോപ്പി നമ്പറിന്റെ കണക്കുകൂട്ടലിനെ സമ്പൂർണ്ണ അളവ് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.മറ്റൊരു റഫറൻസ് സാമ്പിളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ഒരു നിർദ്ദിഷ്ട സാമ്പിളിലെ ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ അളവിൽ വരുന്ന മാറ്റമാണ് ആപേക്ഷിക അളവ് വഴി ലഭിക്കുന്ന ഫലം, കൂടാതെ ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ അപ്-റെഗുലേറ്റഡ് അല്ലെങ്കിൽ ഡൗൺ-റെഗുലേറ്റഡ് ആണ്.

ചോദ്യം: ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കാര്യക്ഷമത, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത എന്നിവ പരീക്ഷണ ഫലങ്ങളെ ബാധിക്കുമോ?
ചോദ്യം: സാമ്പിൾ സ്‌റ്റോറേജ്, എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷൻ റിയാഗന്റുകൾ, റിവേഴ്‌സ് ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്ഷൻ റിയാജന്റുകൾ, ലൈറ്റ് ട്രാൻസ്മിറ്റിംഗ് കൺസ്യൂമബിൾസ് എന്നിവ പരീക്ഷണ ഫലങ്ങളെ ബാധിക്കുമോ?
ചോദ്യം: ഏത് രീതിയിലാണ് പരീക്ഷണ ഡാറ്റ ശരിയാക്കാൻ കഴിയുക?

ഈ പ്രശ്‌നങ്ങളെക്കുറിച്ച്, ചുവടെയുള്ള വിപുലമായതും വിപുലമായതുമായ വിഭാഗങ്ങളിൽ ഞങ്ങൾ അവ വിശദമായി വിവരിക്കും.
2. വിപുലമായ അറിവ്

തത്സമയ ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആറിനെ സംബന്ധിച്ചിടത്തോളം, ആയിരക്കണക്കിന് ശാസ്ത്ര ഗവേഷണ പ്രബന്ധങ്ങൾ ഓരോ വർഷവും പ്രസിദ്ധീകരിക്കപ്പെടുന്നു എന്ന യാഥാർത്ഥ്യം നാം തിരിച്ചറിയണം, അവയിൽ ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ സാങ്കേതികവിദ്യ ഒരു ചെറിയ സംഖ്യയല്ല.

ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ പരീക്ഷണം അളക്കുന്നതിന് പൊതുവായ മാനദണ്ഡമില്ലെങ്കിൽ, ഫലങ്ങൾ വ്യാപകമായി വ്യത്യാസപ്പെടാം.ഒരേ ജീവിവർഗത്തിന്റെ അതേ ജീനിന്, ഒരേ പ്രോസസ്സിംഗ് രീതി ഉപയോഗിച്ച്, കണ്ടെത്തൽ ഫലങ്ങളും വ്യാപകമായി വ്യത്യാസപ്പെടും, വൈകി വരുന്നവർക്ക് അതേ ഫലങ്ങൾ ആവർത്തിക്കുന്നത് ബുദ്ധിമുട്ടായിരിക്കും.ഏതാണ് ശരി, ഏതാണ് തെറ്റ് എന്ന് നിങ്ങൾക്ക് ആർക്കും അറിയില്ല.

ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ ഒരു തട്ടിപ്പ് സാങ്കേതികവിദ്യയാണോ അതോ വിശ്വസനീയമല്ലാത്ത സാങ്കേതികവിദ്യയാണോ എന്നാണോ ഇതിനർത്ഥം?അല്ല, ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ കൂടുതൽ സെൻസിറ്റീവും കൂടുതൽ കൃത്യവുമാണ്, കൂടാതെ ഒരു ചെറിയ തെറ്റായ പ്രവർത്തനം തികച്ചും വിപരീത ഫലങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കും.ഒരു ചെറിയ നഷ്ടം ആയിരം മൈൽ അകലെയാണ്.ലേഖനത്തിന്റെ രചയിതാവ് നിരൂപകർ ആവർത്തിച്ച് പീഡിപ്പിക്കപ്പെട്ടേക്കാം.അതേ സമയം, ജേണലിന്റെ നിരൂപകർക്ക് വ്യത്യസ്ത പരീക്ഷണ ഫലങ്ങളിൽ നിന്ന് തിരഞ്ഞെടുക്കാനും ബുദ്ധിമുട്ടാണ്.

മൊത്തത്തിൽ, തത്സമയ പിസിആർ പരീക്ഷണങ്ങളിലെ സമവായത്തിന്റെ അഭാവത്തിലേക്ക് വിരൽ ചൂണ്ടുന്നു.ഇതിനായി, വ്യവസായത്തിലെ മുതിർന്ന ശാസ്ത്രജ്ഞർ മാനദണ്ഡങ്ങൾ രൂപപ്പെടുത്താൻ തുടങ്ങി.ഈ മാനദണ്ഡങ്ങൾ പാലിക്കുന്നതിനായി ലേഖനത്തിൽ ആവശ്യമായ ചില പരീക്ഷണാത്മകവും ഡാറ്റ പ്രോസസ്സിംഗ് വിശദാംശങ്ങളും (ആവശ്യമായ ഡാറ്റ ഉൾപ്പെടെ) നൽകാൻ സംഭാവന ചെയ്യുന്നവരോട് ആവശ്യപ്പെടുന്നു.

ഈ വിശദാംശങ്ങൾ വായിച്ചുകൊണ്ട് നിരൂപകർക്ക് പരീക്ഷണത്തിന്റെ ഗുണനിലവാരം വിലയിരുത്താനാകും;പരീക്ഷണം ആവർത്തിക്കുന്നതിനോ പരീക്ഷണം മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനോ ഭാവിയിലെ വായനക്കാർക്കും ഇത് ഉപയോഗിക്കാം.അപ്പോൾ ഈ രീതിയിൽ ലഭിച്ച പരീക്ഷണ ഫലങ്ങൾ വിവരങ്ങൾ നിറഞ്ഞതും ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ളതും ഉപയോഗയോഗ്യവുമാണ്.

MIBBI (ബയോളജിക്കൽ, ബയോമെഡിക്കൽ ഇൻവെസ്റ്റിഗേഷനുകൾക്കുള്ള ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ വിവരങ്ങൾ -http://www.mibbi.org) നിലവിൽ വന്നു.പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക് മാനദണ്ഡങ്ങൾ നൽകുന്ന ഒരു പദ്ധതിയാണ് MIBBI.ഇത് പ്രകൃതിയിൽ പ്രസിദ്ധീകരിക്കുന്നു.സെൽ ബയോളജി, മൈക്രോഅറേ, നമ്മൾ ഇപ്പോൾ ചർച്ച ചെയ്യാൻ പോകുന്ന qPCR മുതലായവ ഉൾപ്പെടെയുള്ള വിവിധ ജൈവ പരീക്ഷണങ്ങൾ ഈ പ്രോജക്റ്റ് ലക്ഷ്യമിടുന്നു, കൂടാതെ കൈയെഴുത്തുപ്രതികൾ സമർപ്പിക്കുമ്പോൾ ഓരോ തരത്തിലുള്ള പരീക്ഷണത്തിനും ഇത് നൽകുന്നു.ആ വിവരം എല്ലായ്‌പ്പോഴും നൽകണം.

MIBBI പ്രോജക്റ്റിൽ, ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആറുമായി ബന്ധപ്പെട്ട രണ്ട് ലേഖനങ്ങളുണ്ട്, അതായത്:
·ആർഡിഎംഎൽ (റിയൽ-ടൈം പിസിആർ ഡാറ്റാ മാർക്കപ്പ് ലാംഗ്വേജ്) - തത്സമയ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ ഡാറ്റയ്ക്കുള്ള ഘടനാപരമായ ഭാഷയും റിപ്പോർട്ടിംഗ് ഗൈഡും;
·MIQE (ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് റിയൽ-ടൈം പിസിആർ പരീക്ഷണങ്ങളുടെ പ്രസിദ്ധീകരണത്തിനുള്ള ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ വിവരങ്ങൾ) - തത്സമയ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ പരീക്ഷണങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള ലേഖനങ്ങൾ പ്രസിദ്ധീകരിക്കുന്നതിനുള്ള ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ വിവരങ്ങൾ.
ആദ്യം, ടെർമിനോളജി സ്പെസിഫിക്കേഷനായ RDML നെക്കുറിച്ച് സംസാരിക്കാം.

എല്ലാത്തിനും സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡെഫനിഷൻ ഇല്ലെങ്കിൽ, ചർച്ച തുടരുന്നത് അസാധ്യമാണ്, അതിനാലാണ് പദങ്ങളുടെ വിശദീകരണം പരീക്ഷയിൽ വളരെ പ്രധാനമായത്.
ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR പരീക്ഷണത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന പദാവലിയിൽ ഇനിപ്പറയുന്ന ഉള്ളടക്കം ഉൾപ്പെടുന്നു.QIAGEN ഞങ്ങൾക്കായി ഏറ്റവും മികച്ച സംഗ്രഹം ഉണ്ടാക്കി.ഇനിപ്പറയുന്നവയെല്ലാം വരണ്ടതാണ്സാധനങ്ങൾ .

ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ്
ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ് എന്നത് പിസിആർ പ്രക്രിയയ്ക്കിടെ ഉണ്ടാക്കിയ വക്രത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, സൈക്കിൾ നമ്പർ അബ്‌സിസ്സയായും ഓർഡിനേറ്റ് ആയി പ്രതിപ്രവർത്തന സമയത്ത് തത്സമയ ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രതയുമാണ്.

ഒരു മികച്ച ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വക്രത്തിന് ഇനിപ്പറയുന്ന സവിശേഷതകൾ ഉണ്ടായിരിക്കണം: ബേസ്‌ലൈൻ പരന്നതോ ചെറുതായി കുറയുന്നതോ ആണ്, വ്യക്തമായ മുകളിലേക്കുള്ള പ്രവണതയില്ല;വക്രത്തിന്റെ ഇൻഫ്ലക്ഷൻ പോയിന്റ് വ്യക്തമാണ്, എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ഘട്ടത്തിന്റെ ചരിവ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയ്ക്ക് ആനുപാതികമാണ്.ചരിവ് കൂടുന്തോറും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത വർദ്ധിക്കും;മൊത്തത്തിലുള്ള ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ് സമാന്തരത നല്ലതാണ്, ഇത് ഓരോ ട്യൂബിന്റെയും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത സമാനമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു;കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയുള്ള സാമ്പിളുകളുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവിന്റെ എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ഘട്ടം വ്യക്തമാണ്.

അടിസ്ഥാനരേഖ (അടിസ്ഥാനം)
ആദ്യകാല ചക്രത്തിന്റെ ശബ്ദ നിലയാണ് അടിസ്ഥാനം, സാധാരണയായി 3-ഉം 15-ഉം സൈക്കിളിന് ഇടയിലാണ് അളക്കുന്നത്, കാരണം ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നം മൂലമുണ്ടാകുന്ന ഫ്ലൂറസെൻസ് മൂല്യ വർദ്ധനവ് ഈ കാലയളവിൽ കണ്ടെത്താൻ കഴിയില്ല.ബേസ്‌ലൈൻ കണക്കാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം വ്യത്യാസപ്പെടാം, ഉയർന്ന ടെംപ്ലേറ്റ് തുകകൾ ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ അല്ലെങ്കിൽ ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവൽ ഉയർന്നതാണെങ്കിൽ അത് കുറയ്ക്കേണ്ടി വന്നേക്കാം.

ബേസ്‌ലൈൻ സജ്ജീകരിക്കുന്നതിന് ലീനിയറിറ്റി ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവിൽ നിന്ന് ഫ്ലൂറസെൻസ് ഡാറ്റ കാണേണ്ടതുണ്ട്.ബേസ്‌ലൈൻ സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നതിനാൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വക്രത്തിന്റെ വളർച്ച ആരംഭിക്കുന്നത് ബേസ്‌ലൈൻ സൈക്കിൾ ടോപ്പ് നമ്പറിനേക്കാൾ വലുതാണ്.ഓരോ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസിനും അടിസ്ഥാനങ്ങൾ വ്യക്തിഗതമായി സജ്ജീകരിക്കേണ്ടതുണ്ട്.ആദ്യകാല സൈക്കിളുകളിൽ കണ്ടെത്തിയ ശരാശരി ഫ്ലൂറസെൻസ് മൂല്യങ്ങൾ ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നങ്ങളിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച ഫ്ലൂറസെൻസ് മൂല്യങ്ങളിൽ നിന്ന് കുറയ്ക്കേണ്ടതുണ്ട്.വിവിധ തത്സമയ PCR സോഫ്‌റ്റ്‌വെയറിന്റെ ഏറ്റവും പുതിയ പതിപ്പുകൾ വ്യക്തിഗത സാമ്പിളുകൾക്കായുള്ള അടിസ്ഥാന ക്രമീകരണങ്ങളുടെ സ്വയമേവ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ അനുവദിക്കുന്നു.

പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രതികരണത്തിന്റെ ആദ്യ കുറച്ച് സൈക്കിളുകളിൽ, ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നൽ വലിയ മാറ്റമൊന്നും വരുത്തില്ല.ഒരു നേർരേഖയെ സമീപിക്കുന്നതിനെ ബേസ്‌ലൈൻ എന്ന് വിളിക്കുന്നു, എന്നാൽ ആദ്യത്തെ കുറച്ച് സൈക്കിളുകൾ സൂക്ഷ്മമായി പരിശോധിച്ചാൽ, ചുവടെയുള്ള ചിത്രത്തിൽ എന്താണ് സംഭവിക്കുന്നതെന്ന് നമുക്ക് കാണാം.

പശ്ചാത്തല പശ്ചാത്തലം സൂചിപ്പിക്കുന്നത്
പ്രതികരണത്തിലെ നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ഫ്ലൂറസെൻസ് മൂല്യം.ഉദാഹരണത്തിന്: കാര്യക്ഷമമല്ലാത്ത ഫ്ലൂറസെൻസ് കെടുത്തൽ;അല്ലെങ്കിൽ SYBR ഗ്രീൻ ഉപയോഗം കാരണം ധാരാളം ഇരട്ട-ധാരയുള്ള DNA ടെംപ്ലേറ്റുകൾ.സിഗ്നലിന്റെ പശ്ചാത്തല ഘടകങ്ങൾ തത്സമയ PCR സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ അൽഗോരിതം വഴി ഗണിതശാസ്ത്രപരമായി നീക്കംചെയ്യുന്നു.

റിപ്പോർട്ടർ സിഗ്നൽ
തത്സമയ PCR സമയത്ത് SYBR ഗ്രീൻ അല്ലെങ്കിൽ ഫ്ലൂറസന്റ് ലേബൽ ചെയ്ത സീക്വൻസ്-സ്പെസിഫിക് പ്രോബുകൾ സൃഷ്ടിച്ച ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലിനെ റിപ്പോർട്ടർ സിഗ്നൽ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

നോർമലൈസ്ഡ് റിപ്പോർട്ടർ സിഗ്നൽ (RN)
ഓരോ സൈക്കിളിലും അളക്കുന്ന നിഷ്ക്രിയ റഫറൻസ് ഡൈയുടെ ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത കൊണ്ട് ഹരിച്ച റിപ്പോർട്ടർ ഡൈയുടെ ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രതയെ RN സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

നിഷ്ക്രിയ റഫറൻസ് ഡൈ
ചില തത്സമയ PCR-കളിൽ,ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലിനെ നോർമലൈസ് ചെയ്യുന്നതിനുള്ള ആന്തരിക റഫറൻസായി ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈ ROX ഉപയോഗിക്കുന്നു.കൃത്യമല്ലാത്ത പൈപ്പറ്റിംഗ്, കിണർ സ്ഥാനം, ഫ്ലൂറസെൻസ് ഏറ്റക്കുറച്ചിലുകൾ എന്നിവ മൂലമുള്ള വ്യതിയാനങ്ങളെ ഇത് നന്നായി ശരിയാക്കുന്നു.

ഫ്ലൂറസെൻസ് ത്രെഷോൾഡ് (ത്രെഷോൾഡ്)
പശ്ചാത്തല മൂല്യത്തിന് മുകളിലും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവിന്റെ പീഠഭൂമി മൂല്യത്തിന് താഴെയും ക്രമീകരിച്ചു.ഇത് പിസിആർ കണ്ടെത്തലിന്റെ ലോഗ്-ലീനിയർ ശ്രേണിയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവിന്റെ ലീനിയർ മേഖലയിൽ ആയിരിക്കണം.പിസിആറിന്റെ ലോഗ്-ലീനിയർ ഘട്ടം എളുപ്പത്തിൽ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയുന്ന തരത്തിൽ ലോഗ്-ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ് വ്യൂവിൽ ത്രെഷോൾഡുകൾ സജ്ജീകരിക്കണം.റിയൽ-ടൈം PCR-ൽ ഒന്നിലധികം ടാർഗെറ്റ് ജീനുകൾ ഉണ്ടെങ്കിൽ, ഓരോ ലക്ഷ്യത്തിനും പരിധി സജ്ജീകരിക്കണം.സാധാരണയായി, PCR പ്രതികരണത്തിന്റെ ആദ്യ 15 സൈക്കിളുകളുടെ ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നൽ ഫ്ലൂറസെൻസ് പശ്ചാത്തല സിഗ്നലായി ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഫ്ലൂറസെൻസ് ത്രെഷോൾഡ് പിസിആറിന്റെ ആദ്യത്തെ 3 മുതൽ 15 വരെ സൈക്കിളുകളുടെ ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നലിന്റെ 10 മടങ്ങ് സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനാണ്, കൂടാതെ പിസിആർ ആംപ്ലൻഷ്യൽ ഘട്ടത്തിൽ ഫ്ലൂറസെൻസ് ത്രെഷോൾഡ് സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.സാധാരണയായി, ഓരോ ഉപകരണത്തിനും ഉപയോഗത്തിന് മുമ്പ് അതിന്റെ ഫ്ലൂറസെൻസ് പരിധി നിശ്ചയിച്ചിട്ടുണ്ട്.

സൈക്കിൾ ത്രെഷോൾഡ് (CT) അല്ലെങ്കിൽ ക്രോസിംഗ് പോയിന്റ് (CP)
ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ് പരിധി കടക്കുന്ന ചക്രം (അതായത്, ഫ്ലൂറസെൻസ് കണ്ടെത്തൽ ഗണ്യമായി വർദ്ധിക്കുന്ന പോയിന്റ്).CT ഒരു ഭിന്നസംഖ്യയാകാം, കൂടാതെ ആരംഭ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ അളവ് കണക്കാക്കാം.ഓരോ PCR റിയാക്ഷൻ ട്യൂബിലെയും ഫ്ലൂറസന്റ് സിഗ്നൽ സെറ്റ് ത്രെഷോൾഡിൽ എത്തുമ്പോൾ അനുഭവിച്ച സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണത്തെ CT മൂല്യം പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.ഓരോ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെയും CT മൂല്യവും ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ പ്രാരംഭ കോപ്പി നമ്പറിന്റെ ലോഗരിതം തമ്മിൽ ഒരു രേഖീയ ബന്ധമുണ്ട്,പ്രാരംഭ കോപ്പി നമ്പർ ഉയർന്നാൽ, CT മൂല്യം ചെറുതാണ്, തിരിച്ചും.അറിയപ്പെടുന്ന പ്രാരംഭ പകർപ്പ് നമ്പറുള്ള ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഉപയോഗിച്ച് ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് നിർമ്മിക്കാൻ കഴിയും, അതിൽ abscissa CT മൂല്യത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഓർഡിനേറ്റ് പ്രാരംഭ പകർപ്പ് നമ്പറിന്റെ ലോഗരിതം പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.അതിനാൽ, അജ്ഞാത സാമ്പിളിന്റെ CT മൂല്യം ലഭിക്കുന്നിടത്തോളം, സാമ്പിളിന്റെ പ്രാരംഭ പകർപ്പ് നമ്പർ സാധാരണ വക്രത്തിൽ നിന്ന് കണക്കാക്കാം.

ΔCT മൂല്യം
ΔCT മൂല്യം വിവരിക്കുന്നുടാർഗെറ്റ് ജീനും അനുബന്ധ എൻഡോജെനസ് റഫറൻസ് ജീൻ സിടി മൂല്യവും തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസം, ഒരു ഹൗസ് കീപ്പിംഗ് ജീൻ പോലെയുള്ള, ഉപയോഗിച്ച ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ അളവ് സാധാരണ നിലയിലാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു:
⇒ΔCT = CT (ടാർഗെറ്റ് ജീൻ) - CT (എൻഡോജെനസ് റഫറൻസ് ജീൻ)

ΔΔCT മൂല്യം
ΔΔCT മൂല്യം താൽപ്പര്യമുള്ള സാമ്പിളിന്റെ ശരാശരി ΔΔCT മൂല്യവും (ഉദാഹരണത്തിന്, ഉത്തേജിതമായ സെല്ലുകൾ) ഒരു റഫറൻസ് സാമ്പിളിന്റെ ശരാശരി ΔΔCT മൂല്യവും (ഉദാ, ഉത്തേജിപ്പിക്കാത്ത സെല്ലുകൾ) തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസം വിവരിക്കുന്നു.റഫറൻസ് സാമ്പിളിനെ കാലിബ്രേഷൻ സാമ്പിൾ എന്നും വിളിക്കുന്നു, കൂടാതെ മറ്റെല്ലാ സാമ്പിളുകളും ആപേക്ഷിക അളവിനായി ഇതിലേക്ക് നോർമലൈസ് ചെയ്യുന്നു:
⇒ΔΔCT = ശരാശരി ΔCT (താൽപ്പര്യത്തിന്റെ മാതൃക) - ശരാശരി ΔCT (റഫറൻസ് സാമ്പിൾ)

എൻഡോജെനസ് റഫറൻസ് ജീനുകൾ (എൻഡോജെനസ് റഫറൻസ് ജീനുകൾ)
ഹൗസ് കീപ്പിംഗ് ജീനുകൾ (ഹൗസ് കീപ്പിംഗ് ജീനുകൾ) പോലെയുള്ള എൻഡോജെനസ് റഫറൻസ് ജീനുകളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലുകൾ സാമ്പിളുകൾക്കിടയിൽ വ്യത്യാസമില്ല.റഫറൻസ് ജീനിന്റെ CT മൂല്യങ്ങളെ ടാർഗെറ്റ് ജീനുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുന്നത്, ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവൽ ഇൻപുട്ട് RNA അല്ലെങ്കിൽ cDNA യുടെ അളവിലേക്ക് നോർമലൈസ് ചെയ്യാൻ അനുവദിക്കുന്നു (മുകളിലുള്ള ΔCT മൂല്യങ്ങളിലെ വിഭാഗം കാണുക).

ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനുകൾ ശരിയാണ്സാധ്യമായ ആർഎൻഎ ഡീഗ്രഡേഷൻ അല്ലെങ്കിൽ ആർഎൻഎ സാമ്പിളുകളിൽ എൻസൈം ഇൻഹിബിറ്ററുകളുടെ സാന്നിധ്യം, അതുപോലെ ആർഎൻഎ ഉള്ളടക്കത്തിലെ വ്യത്യാസങ്ങൾ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കാര്യക്ഷമത, ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വീണ്ടെടുക്കൽ, സാമ്പിൾ കൈകാര്യം ചെയ്യൽ.ഒപ്റ്റിമൽ റഫറൻസ് ജീൻ(കൾ) തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന്, പരീക്ഷണാത്മക ക്രമീകരണത്തെ ആശ്രയിച്ച് ഒപ്റ്റിമൽ റഫറൻസ് തിരഞ്ഞെടുക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ അൽഗോരിതം പരിഷ്കരിച്ചു.

ആന്തരിക നിയന്ത്രണം
ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസിന്റെ അതേ പ്രതികരണത്തിൽ വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും മറ്റൊരു അന്വേഷണം (അതായത്, ഡ്യുപ്ലെക്സ് പിസിആർ നടത്തുകയും ചെയ്യുന്നു) ഉപയോഗിച്ച് അന്വേഷിക്കുന്ന ഒരു നിയന്ത്രണ ശ്രേണി.ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് കണ്ടെത്താത്തത് പോലുള്ള, പരാജയപ്പെട്ട ആംപ്ലിഫിക്കേഷനുകൾ ഒഴിവാക്കാൻ ആന്തരിക നിയന്ത്രണങ്ങൾ പലപ്പോഴും ഉപയോഗിക്കാറുണ്ട്.
കാലിബ്രേഷൻ സാമ്പിൾ
ഒരു റഫറൻസ് സാമ്പിൾ (ഉദാഹരണത്തിന്, ഒരു സെൽ ലൈനിൽ നിന്നോ ടിഷ്യൂവിൽ നിന്നോ ഉള്ള ശുദ്ധീകരിച്ച RNA) ഒരു ജീനിന്റെ ആപേക്ഷിക എക്സ്പ്രഷൻ ലെവൽ നിർണ്ണയിക്കാൻ മറ്റെല്ലാ സാമ്പിളുകളും താരതമ്യം ചെയ്യാൻ ആപേക്ഷിക അളവിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു.കാലിബ്രേഷൻ സാമ്പിൾ ഏത് സാമ്പിളും ആകാം, പക്ഷേ സാധാരണയായി ഒരു നിയന്ത്രണമാണ് (ഉദാഹരണത്തിന്, ചികിത്സിക്കാത്ത സാമ്പിൾ അല്ലെങ്കിൽ പരീക്ഷണത്തിന്റെ പൂജ്യത്തിൽ നിന്നുള്ള സാമ്പിൾ).

പോസിറ്റീവ് നിയന്ത്രണങ്ങൾ
ഉപയോഗിച്ച് നിയന്ത്രണ പ്രതികരണങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുകടെംപ്ലേറ്റിന്റെ അറിയപ്പെടുന്ന തുകകൾ.ഒരു പ്രൈമർ സെറ്റ് അല്ലെങ്കിൽ പ്രൈമർ-പ്രോബ് സെറ്റ് ശരിയായി പ്രവർത്തിക്കുന്നുണ്ടെന്നും പ്രതികരണം ശരിയായി സജ്ജീകരിച്ചിട്ടുണ്ടെന്നും പരിശോധിക്കാൻ പോസിറ്റീവ് നിയന്ത്രണങ്ങൾ പലപ്പോഴും ഉപയോഗിക്കാറുണ്ട്.

ടെംപ്ലേറ്റ് നിയന്ത്രണമില്ല (NTC)
സാധാരണയായി വെള്ളം ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്ന ടെംപ്ലേറ്റ് ഒഴികെയുള്ള ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രതികരണത്തിന്റെ ആവശ്യമായ എല്ലാ ഘടകങ്ങളും ഉൾക്കൊള്ളുന്ന ഒരു നിയന്ത്രണ പ്രതികരണം.എൻടിസിയുടെ ഉപയോഗത്തിന് റീജന്റ് മലിനീകരണം അല്ലെങ്കിൽ വിദേശ ഡിഎൻഎ മൂലമുണ്ടാകുന്ന മലിനീകരണം കണ്ടെത്താനാകും, അങ്ങനെ കണ്ടെത്തൽ ഡാറ്റയുടെ ആധികാരികതയും വിശ്വാസ്യതയും ഉറപ്പാക്കുന്നു.NTC നിയന്ത്രണത്തിന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ മലിനീകരണത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

RT നിയന്ത്രണമില്ല (NRT)
ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ പ്രക്രിയയിൽ ശേഷിക്കുന്ന ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ അടങ്ങിയിരിക്കാം, അത് അത്യന്തം ഹാനികരവും ഡാറ്റയുടെ ഗുണനിലവാരത്തെയും qPCR ന്റെ സ്വാഭാവിക ശത്രുവിനെയും ബാധിക്കുന്ന കുറ്റവാളിയുമാണ്, അതിനാൽ പരീക്ഷണങ്ങൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുമ്പോൾ, അത് ആർഎൻഎ കണ്ടെത്തൽ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ മാത്രം രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിരിക്കണം.രണ്ട് വഴികളുണ്ട്, ഒന്ന് ഇൻട്രോണുകളിലുടനീളം പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുക, മറ്റൊന്ന് ഡിഎൻഎ പൂർണ്ണമായും നീക്കംചെയ്യുക, ഏതാണ് നല്ലത്, അത് പിന്നീട് ചർച്ചചെയ്യും.എൻടിആർ കൺട്രോൾ ഡിഎൻഎ മലിനീകരണം കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള ഒരു മാന്ത്രിക കണ്ണാടിയാണ്.ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉണ്ടെങ്കിൽ, അതിനർത്ഥം മലിനീകരണം ഉണ്ടെന്നാണ്.

മാനദണ്ഡങ്ങൾ
ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് നിർമ്മിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന അറിയപ്പെടുന്ന കോൺസൺട്രേഷന്റെയോ കോപ്പി നമ്പറിന്റെയോ സാമ്പിളുകളാണ് സ്റ്റാൻഡേർഡുകൾ.സ്റ്റാൻഡേർഡിന്റെ സ്ഥിരത ഉറപ്പാക്കാൻ, ജീൻ ശകലം സാധാരണയായി പ്ലാസ്മിഡിലേക്ക് ക്ലോൺ ചെയ്യുകയും സ്റ്റാൻഡേർഡായി ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.

സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ്
സാധാരണയായി ഇരട്ടിപ്പിക്കൽ അനുപാതം അനുസരിച്ച് സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഉൽപ്പന്നത്തിനൊപ്പം കുറഞ്ഞത് 5 കോൺസൺട്രേഷൻ ഗ്രേഡിയന്റുകളായി ലയിപ്പിക്കുന്നു, കൂടാതെ CT മൂല്യത്തിന്റെയും കോപ്പി നമ്പറിന്റെയും കോർഡിനേറ്റുകളിൽ 5 പോയിന്റുകൾ വരയ്ക്കുന്നു, കൂടാതെ ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് സൃഷ്ടിക്കുന്നതിന് പോയിന്റുകൾ ഒരു ലൈൻ രൂപപ്പെടുത്തുന്നതിന് ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു.ഓരോ സാധാരണ വക്രത്തിനും, അതിന്റെ സാധുത പരിശോധിക്കേണ്ടതുണ്ട്.ചരിവ് മൂല്യം -3.3 നും -3.8 നും ഇടയിൽ വീഴുന്നു, കൂടാതെ ഓരോ ഏകാഗ്രതയും മൂന്ന് തവണയായി നടത്തുന്നു.മറ്റ് പോയിന്റുകളിൽ നിന്ന് കാര്യമായ വ്യത്യാസമുള്ള പോയിന്റുകൾ ഉപേക്ഷിക്കണം.പരിശോധിക്കേണ്ട സാമ്പിളിന്റെ സിടി മൂല്യം സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവിലേക്ക് കൊണ്ടുവരുന്നു, കൂടാതെ പരിശോധിക്കേണ്ട സാമ്പിളിന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവൽ കണക്കാക്കാം.

പരിശോധിക്കേണ്ട സാമ്പിളിന്റെ സിടി മൂല്യം സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവിലേക്ക് കൊണ്ടുവരുന്നു, കൂടാതെ പരിശോധിക്കേണ്ട സാമ്പിളിന്റെ പ്രാരംഭ കോപ്പി നമ്പർ കണക്കാക്കാം.

കാര്യക്ഷമതയും ചരിവും
സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവിന്റെ ചരിവ് തത്സമയ PCR-ന്റെ കാര്യക്ഷമതയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
·-3.322 ന്റെ ചരിവ് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത 1 അല്ലെങ്കിൽ 100% കാര്യക്ഷമമാണെന്നും ഓരോ സൈക്കിളിലും പിസിആർ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ അളവ് ഇരട്ടിയാകുന്നു.
·-3.322 (ഉദാ, –3.8)-ൽ താഴെയുള്ള ചരിവ് ഒരു PCR കാര്യക്ഷമതയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു
·-3.322 (ഉദാ, –3.0)-ൽ കൂടുതലുള്ള ഒരു ചരിവ് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് പിസിആർ കാര്യക്ഷമത 100%-ൽ കൂടുതലാണെന്ന് തോന്നുന്നു, ഇത് കൗതുകകരമാണ്, എങ്ങനെയാണ് പിസിആറിന്റെ ഒരു ചക്രം ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ ഇരട്ടിയിലധികം സൃഷ്ടിക്കുന്നത്?പിസിആർ പ്രതികരണത്തിന്റെ രേഖീയമല്ലാത്ത ഘട്ടത്തിലാണ് ഈ സാഹചര്യം സംഭവിക്കുന്നത്, അതായത്, ഒരു വലിയ അളവിലുള്ള നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉണ്ട്.

ഉരുകുന്ന വക്രം
qPCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പൂർത്തിയായ ശേഷം, PCR ഉൽപ്പന്നം ചൂടാക്കപ്പെടുന്നു.താപനില ഉയരുമ്പോൾ, ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നം ക്രമേണ ഉരുകുന്നു, അതിന്റെ ഫലമായി ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത കുറയുന്നു.ഒരു നിശ്ചിത താപനില (Tm) എത്തുമ്പോൾ, ധാരാളം ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ഉരുകിപ്പോകും.ഫ്ലൂറസെൻസ് കുത്തനെ കുറയുന്നു.വ്യത്യസ്‌ത പി‌സി‌ആർ ഉൽ‌പ്പന്നങ്ങൾക്ക് വ്യത്യസ്‌ത Tm മൂല്യങ്ങളും വ്യത്യസ്‌ത ഉരുകൽ താപനിലയും ഉണ്ട്, അതിനാൽ പി‌സി‌ആറിന്റെ പ്രത്യേകത തിരിച്ചറിയാൻ‌ കഴിയും.

മെൽറ്റിംഗ് കർവ് (ഡെറിവേറ്റീവ് കർവ്)
പിസിആർ ഉൽപ്പന്ന ശകലങ്ങളുടെ സാഹചര്യം കൂടുതൽ അവബോധപൂർവ്വം പ്രദർശിപ്പിക്കാൻ കഴിയുന്ന ഒരു പീക്ക് മാപ്പ് രൂപപ്പെടുത്തുന്നതിനാണ് ഉരുകുന്ന വക്രം ഉരുത്തിരിഞ്ഞത്.ഉരുകുന്ന താപനില ഡിഎൻഎ ശകലത്തിന്റെ Tm മൂല്യമായതിനാൽ, ഡിഎൻഎ ശകലത്തിന്റെ Tm മൂല്യത്തെ ബാധിക്കുന്ന ചില പാരാമീറ്ററുകൾ വിഭജിക്കാം, അതായത് ശകലത്തിന്റെ വലിപ്പം, GC ഉള്ളടക്കം മുതലായവ. പൊതുവായി പറഞ്ഞാൽ, ഞങ്ങളുടെ പ്രൈമർ ഡിസൈൻ തത്വങ്ങൾ അനുസരിച്ച്,ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ ദൈർഘ്യം 80-300 ബിപി പരിധിയിലാണ്, അതിനാൽ ഉരുകൽ താപനില 80 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിനും 90 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിനും ഇടയിലായിരിക്കണം.

ഉരുകൽ വക്രത്തിന്റെ വ്യാഖ്യാനം: 80°C-90°C വരെ പ്രധാന കൊടുമുടി ദൃശ്യമാകുകയാണെങ്കിൽ, ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR തികഞ്ഞതാണെന്ന് അർത്ഥമാക്കുന്നു;പ്രധാന കൊടുമുടി 80°C-90°C നും മറ്റുമുള്ള കൊടുമുടികൾ 80°C-ന് താഴെയും ദൃശ്യമാകുകയാണെങ്കിൽ, പ്രൈമർ ഡൈമർ അടിസ്ഥാനപരമായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു.അത് പരിഹരിക്കാൻ അനീലിംഗ് താപനില വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ നിങ്ങൾക്ക് ശ്രമിക്കാം;പ്രധാന കൊടുമുടി 80 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ്-90 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിനുമിടയിൽ ദൃശ്യമാകുകയും താപനില ഉയരുമ്പോൾ വിവിധ കൊടുമുടികൾ വീണ്ടും പ്രത്യക്ഷപ്പെടുകയും ചെയ്താൽ, ഡിഎൻഎ മലിനീകരണം ഉണ്ടെന്ന് അടിസ്ഥാനപരമായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു, പരീക്ഷണത്തിന്റെ പ്രാരംഭ ഘട്ടത്തിൽ ഡിഎൻഎ നീക്കം ചെയ്യേണ്ടതുണ്ട്.

തീർച്ചയായും, ചില അസാധാരണ സാഹചര്യങ്ങൾ ഇപ്പോഴും ഉണ്ട്, അവ ഓരോന്നായി താഴെയായി വിഭജിക്കും.
3. വിപുലമായ അറിവ്

qPCR ചെയ്യാൻ, ഞാൻ MIQE എന്ന് പറയണം,കുറഞ്ഞ വിവരങ്ങൾപ്രസിദ്ധീകരണത്തിനായിക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ്തത്സമയ പിസിആർപരീക്ഷണങ്ങൾ —തത്സമയ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആറിനെക്കുറിച്ചുള്ള ലേഖനങ്ങൾ പ്രസിദ്ധീകരിക്കുന്നതിനുള്ള ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ വിവരങ്ങൾപരീക്ഷണങ്ങൾ .എല്ലാവരുടെയും ധാരണ ലളിതമാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ പ്രധാന ഉള്ളടക്കം ലളിതമാക്കും.

നിങ്ങൾക്ക് ഇന്റർനെറ്റിൽ MIQE ന്റെ യഥാർത്ഥ വാചകം തിരയാൻ കഴിയും, ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട കാര്യം അത് വ്യവസ്ഥ ചെയ്യുന്നു എന്നതാണ്ഒരു ലേഖനം പ്രസിദ്ധീകരിക്കുമ്പോൾ നൽകേണ്ട ഡാറ്റാ ചെക്ക്‌ലിസ്റ്റ് .

ഈ വിശദാംശങ്ങൾ വായിച്ചുകൊണ്ട് നിരൂപകർക്ക് പരീക്ഷണത്തിന്റെ ഗുണനിലവാരം വിലയിരുത്താനാകും;പരീക്ഷണം ആവർത്തിക്കുന്നതിനോ മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനോ ഭാവിയിലെ വായനക്കാർക്കും ഇത് ഉപയോഗിക്കാം.
ഈ പട്ടികയിൽ, ഓരോ ലിസ്റ്റിന്റെയും പ്രാധാന്യം യഥാക്രമം E അല്ലെങ്കിൽ D ഉപയോഗിച്ച് അടയാളപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്.എന്താണ് ഇതിനർത്ഥം?ഇ: അവശ്യ വിവരങ്ങൾ (സമർപ്പിക്കേണ്ടതാണ്);ഡി: അഭിലഷണീയമായ വിവരങ്ങൾ (കഴിയുന്നത്ര നൽകുക).

MIQE (1)-പരീക്ഷണാത്മക രൂപകൽപ്പന
ബിരുദ പഠനം പൂർത്തിയാക്കിയ ശേഷം പ്രതിരോധം പൂർത്തിയാക്കിയ പല തെമ്മാടികൾക്കും സ്വതന്ത്രമായി ഒരു പരീക്ഷണം എങ്ങനെ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യാമെന്നും നോട്ട്ബുക്കുകൾ തുറക്കാമെന്നും ടീച്ചർ പറയുന്നതുപോലെ ചെയ്യാമെന്നും അറിയില്ല.തൽഫലമായി, പരീക്ഷണ രൂപകൽപന കർശനമായിരുന്നില്ല, ഈ ചിത്രവും ആ ചിത്രവും നിർമ്മിക്കാൻ ആഗ്രഹിക്കുന്നുവെന്ന് മാസികയുടെ എഡിറ്റോറിയൽ വിഭാഗം പറഞ്ഞു, അതിനാൽ അവർ അത് മയക്കത്തിലാണ്.ഇങ്ങിനെയാണ് കഴുതകൾ ഉണ്ടാക്കുന്നത്!

വീടിനടുത്ത്, പരീക്ഷണത്തിന്റെ ആദ്യ തത്വം നിർണ്ണയിക്കുക എന്നതാണ്പരീക്ഷണാത്മക യുക്തിയുടെ കാഠിന്യം.ഏറ്റവും അടിസ്ഥാനപരമായ കാര്യം പരീക്ഷണാത്മക രൂപകല്പനയാണ്, പരീക്ഷണാത്മക രൂപകല്പനയുടെ ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട കാര്യം ടാർഗെറ്റ് സാമ്പിൾ, റഫറൻസ് സാമ്പിൾ (നിയന്ത്രണം), ആവർത്തനങ്ങളുടെ എണ്ണം എന്നിവ എങ്ങനെ സജ്ജീകരിക്കാം എന്നതാണ്.

ലക്ഷ്യ സാമ്പിൾഒരു നിശ്ചിത ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം ടാർഗെറ്റ് ജീൻ കണ്ടെത്തുന്നതിന് ആവശ്യമായ സാമ്പിളിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.റഫറൻസ് സാമ്പിൾഒരു ചികിത്സയും ഇല്ലാത്ത സാമ്പിളാണ്, ജീവശാസ്ത്രത്തിൽ വൈൽഡ് ടൈപ്പ് എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്നു.

പരീക്ഷണാത്മക പകർപ്പുകൾവളരെ പ്രധാനമാണ്.സാധാരണയായി, അനുനയിപ്പിക്കുന്ന പകർപ്പുകളുടെ എണ്ണം മൂന്നിൽ കൂടുതലായിരിക്കണം.ബയോളജിക്കൽ റെപ്ലിക്കേഷൻ എന്താണെന്നും സാങ്കേതിക പകർപ്പ് എന്താണെന്നും വേർതിരിച്ചറിയേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്.

ബയോളജിക്കൽ റെപ്ലിക്കേറ്റുകൾ: വ്യത്യസ്‌ത സാമഗ്രികൾ (സമയം, സസ്യങ്ങൾ, ബാച്ചുകൾ, പ്രതികരണ പ്ലേറ്റുകൾ) ഉപയോഗിച്ച് നടത്തിയ അതേ പരിശോധനാ പരീക്ഷണം.

ജീവശാസ്ത്രപരമായ തനിപ്പകർപ്പ്
കുരുമുളകിന്റെ കീടനാശിനി ചികിത്സ ഉദാഹരണമായി എടുക്കാം.എബിസിയുടെ മൂന്ന് ചെടികളിൽ കീടനാശിനികൾ തളിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ആഗ്രഹിക്കുന്നു, എബിസിയുടെ മൂന്ന് സസ്യങ്ങൾ മൂന്ന് ജൈവ പകർപ്പുകളാണ്, അവ വ്യത്യസ്ത വസ്തുക്കളിൽ നടത്തിയ അതേ പരിശോധനാ പരീക്ഷണമാണ്.എന്നാൽ ഒരു പരീക്ഷണം എന്ന നിലയിൽ, തീർച്ചയായും ഒരു നിയന്ത്രണം ആവശ്യമാണ്, അതിനാൽ പ്ലാന്റ് A യുടെ ഒരു പരീക്ഷണഗ്രൂപ്പ് രൂപീകരിക്കാൻ ചെടിയുടെ ശാഖകളിലൊന്ന് തളിക്കാം, കൂടാതെ ഒരു നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പ് രൂപീകരിക്കുന്നതിന് A യുടെ മറ്റ് ശാഖകളിൽ തളിക്കരുത്.B, C എന്നിവയ്‌ക്കും ഇതുതന്നെ ചെയ്യുക.

സാങ്കേതിക പകർപ്പുകൾ (സാങ്കേതിക പകർപ്പുകൾ): ഓപ്പറേഷൻ മൂലമുണ്ടാകുന്ന പിശകുകൾ ഒഴിവാക്കാൻ രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത ആവർത്തിച്ചുള്ള പരീക്ഷണമാണിത്, യഥാർത്ഥത്തിൽ ഒരേ മെറ്റീരിയലിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്ന ഒരു ഡ്യൂപ്ലിക്കേറ്റ് ദ്വാരമാണിത്.ചികിത്സകൾക്കും നിയന്ത്രണങ്ങൾക്കും ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെയും ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനിന്റെയും പകർപ്പ് ക്രമീകരണങ്ങൾ (കുറഞ്ഞത് മൂന്ന്) ഉണ്ടായിരിക്കണം.

സാങ്കേതിക ആവർത്തനം
കീടനാശിനി പ്രയോഗിച്ച കുരുമുളക് വീണ്ടും ഉദാഹരണമായി എടുക്കുക.പ്ലാന്റ് എ യുടെ പരീക്ഷണാത്മക ഗ്രൂപ്പിനായി, അതിന്റെ ടാർഗെറ്റ് ജീനിനും ഇന്റേണൽ റഫറൻസ് ജീനിനുമായി യഥാക്രമം 1, 2, 3 എന്നിവയുടെ മൂന്ന് പിസിആർ ദ്വാരങ്ങൾ ഞങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കി, അങ്ങനെ കണ്ടെത്തിയതിന് ശേഷം ശരാശരി എടുക്കും.ചെടിയുടെ നിയന്ത്രണത്തിനായി എ ഗ്രൂപ്പുകളേയും ഇതേ രീതിയിൽ പരിഗണിക്കുന്നു.അതുപോലെ, ബി, സി ചെടികൾക്കും ഇതേ ചികിത്സ ചെയ്യുക.ഇത് സാങ്കേതികമായ ആവർത്തനമാണ്.

എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകളിൽ പ്രവേശിക്കുന്നത് ബയോളജിക്കൽ ആവർത്തനമാണ്, കൂടാതെ സാങ്കേതികമായ ആവർത്തനമാണ് പരീക്ഷണ പ്രക്രിയയിൽ എന്തെങ്കിലും ക്രമരഹിതമായ പ്രതിഭാസങ്ങൾ ഉണ്ടോ എന്ന് പരിശോധിക്കുന്നത്, പരീക്ഷണ ഫലങ്ങൾ വിശ്വസനീയമാക്കുന്നതിന്, അതായത്, ഞങ്ങൾ പലപ്പോഴും പറയുന്നത് പോലെ അവയുടെ ശരാശരി എടുത്ത് പിശകുകൾ ഒഴിവാക്കുക.

നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണങ്ങൾ - NTC, NRT
NTC (ടെംപ്ലേറ്റ് നിയന്ത്രണമില്ല), ഒരു ടെംപ്ലേറ്റ് ഇല്ലാത്ത ഒരു നിയന്ത്രണം, പരീക്ഷണാത്മക മെറ്റീരിയൽ മലിനമാണോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു.സാധാരണയായി, വെള്ളം ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഒരു ഫ്ലൂറസന്റ് പ്രതികരണമുണ്ടെങ്കിൽ, ലബോറട്ടറിയിൽ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് മലിനീകരണം സംഭവിച്ചതായി ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

ഈ മലിനീകരണങ്ങൾ ഉണ്ടാകുന്നത്: ശുദ്ധജലം, എൻഡോജെനസ് ഡിഎൻഎ, പ്രൈമർ മലിനീകരണം, ലബോറട്ടറി ഉപകരണ മലിനീകരണം, എയറോസോൾ മലിനീകരണം മുതലായവ അടങ്ങിയ അയോഗ്യമായ റിയാഗന്റുകൾ, RNase സ്കാവഞ്ചറുകളും RNase ഇൻഹിബിറ്ററുകളും ഉപയോഗിക്കേണ്ടതുണ്ട്.എയറോസോൾ മലിനീകരണം കണ്ടെത്താൻ ഏറ്റവും ബുദ്ധിമുട്ടാണ്.നിങ്ങളുടെ ലബോറട്ടറി പുകമഞ്ഞ് പോലെയാണെന്ന് സങ്കൽപ്പിക്കുക, വിവിധ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾ വായുവിൽ സസ്പെൻഡ് ചെയ്യപ്പെടുന്നു.

NRT (നോ-റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്), റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഇല്ലാത്ത നിയന്ത്രണം, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്യാത്ത ആർഎൻഎ നെഗറ്റീവ് കൺട്രോളായി ആണ്, ഇത് gDNA അവശിഷ്ടത്തിന്റെ നിയന്ത്രണമാണ്.

ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ ചെയ്യുമ്പോൾ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനുശേഷം സിഡിഎൻഎയുടെ അളവ് കണ്ടെത്തി ആർഎൻഎയുടെ അളവ് കണ്ടെത്തുന്നു.RNA ശുദ്ധീകരിക്കപ്പെടുമ്പോൾ gDNA അവശിഷ്ടം ഉണ്ടെങ്കിൽ, അത് പരീക്ഷണ ഫലങ്ങളിൽ പിശകുകൾക്ക് കാരണമാകും, കാരണം യഥാർത്ഥ ഫലങ്ങൾ gDNA, cDNA എന്നിവയാണ്.മൊത്തം തലത്തിൽ, cDNA മാത്രമല്ല, RNA വേർതിരിച്ചെടുക്കുമ്പോൾ gDNA പൂർണ്ണമായും നീക്കം ചെയ്യേണ്ടതുണ്ട്.

MIQE (2)-സാമ്പിൾ വിവരങ്ങൾ
സാമ്പിൾ വിവരങ്ങൾ എന്ന് വിളിക്കുന്നത് അർത്ഥമാക്കുന്നത്, ഞങ്ങൾ qPCR നെക്കുറിച്ചുള്ള ഒരു ലേഖനം പ്രസിദ്ധീകരിക്കുമ്പോൾ, സാമ്പിൾ വിവരങ്ങൾ വ്യക്തമായി വിശദീകരിക്കണം, അത് ലേഖനത്തിന്റെ ഒഴിച്ചുകൂടാനാവാത്ത ഭാഗമാണ്.അതുപോലെ, ഞങ്ങൾ സാമ്പിളുകൾ പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുമ്പോൾ, സാമ്പിളുകളുടെ സാധുത ഉറപ്പാക്കാൻ ഞങ്ങളുടെ സ്വന്തം പ്രവർത്തനങ്ങളും നിയന്ത്രിക്കേണ്ടതുണ്ട്.

സാമ്പിളിന്റെ വിവരണം ഒരു ഫലം മാത്രമാണ്, മുഴുവൻ പരീക്ഷണ സമയത്തും എടുത്ത മെറ്റീരിയലുകളിൽ കൂടുതൽ ശ്രദ്ധ ചെലുത്തണം.

പരീക്ഷണാത്മക വസ്തുക്കളുടെ തിരഞ്ഞെടുപ്പ്
രക്ത സാമ്പിളുകൾ - പുതിയ രക്തം തിരഞ്ഞെടുക്കുക, 4 മണിക്കൂറിൽ കൂടരുത്.സെൽ സാമ്പിളുകൾ - ശക്തമായ വളർച്ചയുടെ കാലഘട്ടത്തിൽ പുതിയ സെല്ലുകൾ ശേഖരിക്കാൻ തിരഞ്ഞെടുക്കുക.അനിമൽ ടിഷ്യു - പുതിയതും ശക്തമായി വളരുന്നതുമായ ടിഷ്യു തിരഞ്ഞെടുക്കുക.പ്ലാന്റ് ടിഷ്യു - പുതിയ, യുവ ടിഷ്യു തിരഞ്ഞെടുക്കുക.

ഈ കുറച്ച് വാക്യങ്ങളിൽ ഒരു പ്രധാന വാക്ക് ഉണ്ടെന്ന് നിങ്ങൾ ശ്രദ്ധിച്ചിരിക്കണം: ഫ്രഷ് .
മേൽപ്പറഞ്ഞ സാമ്പിളുകൾക്കായി, വിപണിയിലെ ഏറ്റവും മികച്ചതും ചെലവ് കുറഞ്ഞതും സ്ഥിരതയുള്ളതുമായ കിറ്റ് ഫോർജീന്റെ കിറ്റാണ്, അത് അവരുടെ ഡിഎൻഎയും ആർഎൻഎയും വേഗത്തിലും എളുപ്പത്തിലും വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ കഴിയും.

ബ്ലഡ് ഡിഎൻഎ മിനി കിറ്റ്

സെൽ ടോട്ടൽ RNA ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ്

അനിമൽ ടോട്ടൽ ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ്

പ്ലാന്റ് ടോട്ടൽ RNA ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ്

പ്ലാന്റ് ടോട്ടൽ ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ് പ്ലസ്

പ്ലാന്റ് ഡിഎൻഎ ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ്

പരീക്ഷണാത്മക വസ്തുക്കളുടെ സംഭരണം
പൊതുവായി പറഞ്ഞാൽ, വ്യവസ്ഥകൾ അനുവദിക്കുകയാണെങ്കിൽ, സാമ്പിളുകൾ സൂക്ഷിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നില്ല.എന്നിരുന്നാലും, സാമ്പിളിംഗ് കഴിഞ്ഞ് ഉടൻ തന്നെ പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്താൻ കഴിയാത്ത നിരവധി സുഹൃത്തുക്കളുണ്ട്, ചിലർക്ക് സാമ്പിളിംഗിനായി വയലിലേക്ക് ദ്രാവക നൈട്രജൻ ടാങ്കുകൾ കൊണ്ടുപോകേണ്ടതുണ്ട്.

ഇത്തരത്തിലുള്ള കഠിനാധ്വാനിയായ സുഹൃത്തിന്, നിങ്ങൾക്ക് റീജന്റ് ഉപഭോഗവസ്തുക്കൾ മനസ്സിലാകുന്നില്ല എന്ന് മാത്രമേ എനിക്ക് പറയാൻ കഴിയൂ.ഇപ്പോൾ പല റീജന്റ് ഉപഭോഗ കമ്പനികളും റൂം താപനിലയിൽ ആർഎൻഎ സാമ്പിളുകൾ സംഭരിക്കാൻ കഴിയുന്ന റിയാക്ടറുകൾ നിർമ്മിക്കുന്നു, നിങ്ങൾക്ക് അവ ഉപയോഗിക്കാൻ തിരഞ്ഞെടുക്കാം.കൊണ്ടുപോകാൻ എളുപ്പമുള്ള ഒരു ചെറിയ ലിക്വിഡ് നൈട്രജൻ ടാങ്ക് ഉപയോഗിച്ച് ലിക്വിഡ് നൈട്രജൻ സംഭരണമാണ് പരമ്പരാഗത സംഭരണ ​​രീതി.സാമ്പിൾ വീണ്ടും ലബോറട്ടറിയിലേക്ക് കൊണ്ടുവന്ന ശേഷം -80 ° C റഫ്രിജറേറ്ററിൽ സൂക്ഷിക്കുക.

ആർഎൻഎ ഉൾപ്പെടുന്ന പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക്, ആറ് വാക്കുകളുടെ തത്വം പാലിക്കേണ്ടതുണ്ട്:കുറഞ്ഞ താപനില, എൻസൈമുകൾ ഇല്ല,ഒപ്പംവേഗം .

കുറഞ്ഞ താപനില എന്ന ആശയം മനസ്സിലാക്കാൻ എളുപ്പമാണ്;എൻസൈമുകൾ ഇല്ലാതെ, നമ്മൾ ജീവിക്കുന്ന ലോകത്ത് RNase എല്ലായിടത്തും ഉണ്ട് (അല്ലെങ്കിൽ നിങ്ങൾ HIV ബാധിച്ച് കൊല്ലപ്പെടുമായിരുന്നു), അതിനാൽ പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തുമ്പോൾ RNase എങ്ങനെ ഒഴിവാക്കാം എന്നത് വളരെ പ്രധാനപ്പെട്ട ഒരു ആശയമാണ്;വേഗം,തകർക്കാൻ പറ്റാത്ത കുങ്ഫു ലോകത്തിലില്ല, വേഗത മാത്രം തകർക്കാൻ കഴിയില്ല.

അതിനാൽ, ഒരർത്ഥത്തിൽ, വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ സമയം കുറയുന്നു, കിറ്റ് മികച്ചതാണ്.എന്തുകൊണ്ട് ചെയ്യുന്നുഫോറിൻന്റെ കിറ്റ് വേഗതയെ ഊന്നിപ്പറയുന്നു, കാരണം അവർക്ക് അത് നന്നായി അറിയാം.

PS: ചില പെൺകുട്ടികൾ വളരെ ശ്രദ്ധാപൂർവം പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്താറുണ്ട്, എന്നാൽ വർഷങ്ങളോളം ജോലി ചെയ്തതിന് ശേഷം അവർ ഒരു സ്ലാം ഡങ്ക് പോലെ നല്ലതല്ല.ദൈവം അന്യായമാണെന്നും മറ്റുള്ളവരെക്കുറിച്ച് പരാതിപ്പെടുന്നതായും ജീവനെ അന്വേഷിക്കുന്നതായും അവർ കരുതുന്നു.സത്യത്തിൽ അവൾക്കത് മനസ്സിലായില്ല.അദ്ദേഹം ആർഎൻഎയെ നന്നായി സംരക്ഷിച്ചില്ല, സ്ലാം ഡങ്ക് കളിക്കാരൻ മിടുക്കനായിരുന്നു.പരീക്ഷണം നടത്തുമ്പോൾ മൂന്ന് തവണയും അഞ്ച് തവണയും രണ്ട് ഡിവിഷനുകളും ഉപയോഗിച്ച് സ്ലാം ഡങ്ക് പൂർത്തിയാക്കുമെന്ന് അദ്ദേഹം കരുതി, പക്ഷേ അദ്ദേഹം പരീക്ഷണം നന്നായി നടത്തി.

കുറിപ്പ്: സാവധാനം, RNase അധിനിവേശത്തിന് കൂടുതൽ സാധ്യത.വേഗത്തിൽ പ്രവർത്തിക്കാൻ സ്വയം എങ്ങനെ പരിശീലിപ്പിക്കാം?വഴിയില്ല, കൂടുതൽ പരിശീലിച്ചാൽ മതി.

വ്യത്യസ്ത പരീക്ഷണങ്ങൾക്കും വ്യത്യസ്ത സാമ്പിളുകൾക്കുമായി, കൂടുതൽ സാഹിത്യങ്ങൾ വായിക്കുകയും പ്രോസസ്സിംഗിന് അനുയോജ്യമായ ഒരു രീതി തിരഞ്ഞെടുക്കുകയും ചെയ്യേണ്ടത് ഇപ്പോഴും ആവശ്യമാണ്.സാമ്പിൾ ശേഖരണത്തിനും സംഭരണ ​​പ്രക്രിയയ്‌ക്കും, അത് പേപ്പറിൽ വ്യക്തമായി എഴുതിയിരിക്കണം എന്ന് MIQE ആവശ്യപ്പെടുന്നു, അതുവഴി അവലോകകർക്ക് പേപ്പറിന്റെ വിശ്വാസ്യത അവലോകനം ചെയ്യാൻ കഴിയും, കൂടാതെ നിങ്ങളുടെ പരീക്ഷണം ആവർത്തിക്കാൻ സ്തംഭിച്ച യുവാക്കൾക്ക് ഇത് സൗകര്യപ്രദവുമാണ്.

ജീവശാസ്ത്രപരമായ പരീക്ഷണങ്ങൾ ബുദ്ധിമുട്ടാണെങ്കിലും, അവ ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ളവയാണ്.നിങ്ങൾ ശ്രദ്ധിച്ചില്ലെങ്കിൽ, നിങ്ങൾക്ക് ലോകത്തെ തകിടം മറിക്കാം.ഉദാഹരണത്തിന്, SARS നെ ഒരു ബയോകെമിക്കൽ പ്രതിസന്ധിയാക്കി മാറ്റുക, അല്ലെങ്കിൽ 1.3 ബില്യൺ ആളുകളെ രക്ഷിക്കാൻ ഹൈബ്രിഡ് അരി ഉണ്ടാക്കുക.ചുവടെയുള്ള ചിത്രം ഒരു രാസ പരീക്ഷണമാണ്, അവന്റെ ഡിക്ക് പോലെയുള്ള രൂപം നോക്കി നിങ്ങളുടെ ഗവേഷണത്തിൽ നിങ്ങൾ എത്രമാത്രം അഭിമാനിക്കുന്നു എന്ന് നിങ്ങൾ മനസ്സിലാക്കണം.മറക്കുക, അവനെ കറുപ്പിക്കരുത്.

MIQE (3) - ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ.
ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ ഒരു വലിയ സംഭവമാണ്, എല്ലാ മോളിക്യുലാർ ബയോളജി പരീക്ഷണങ്ങളും ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ ഉപയോഗിച്ച് ആരംഭിക്കുന്നു.ഒന്നാമതായി, ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് എക്‌സ്‌ട്രാക്‌ഷനിൽ MIQE-ന്റെ ഉള്ളടക്കം പകർത്താം.

ഈ ഫോം നോക്കുമ്പോൾ, നിങ്ങൾക്ക് ഉപരിതലത്തിൽ തുടരാൻ കഴിയില്ല.രൂപം ഒരു പിടിവാശിയാണ്.ഒരു മികച്ച വിദ്യാർത്ഥിയാകാൻ, എന്തുകൊണ്ടെന്ന് നിങ്ങൾ ചോദിക്കണം.ഈ പട്ടികയുടെ പ്രധാന ഉള്ളടക്കം ഇതാണ്: പിന്തുടരുകആർഎൻഎയുടെ പരിശുദ്ധി, സമഗ്രത, സ്ഥിരത, വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ അളവ് .

യുടെ ആദ്യഭാഗംപ്രക്രിയ അല്ലെങ്കിൽ ഉപകരണം ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ ഘട്ടമാണ്.എക്‌സ്‌ട്രാക്‌റ്റുചെയ്യാൻ നിങ്ങൾ ഒരു ഓട്ടോമാറ്റിക് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് എക്‌സ്‌ട്രാക്‌റ്റർ ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ (വിപുലമായത്, വാങ്ങുന്നതിന് എന്നെ ബന്ധപ്പെടുക), ഉപകരണത്തിന്റെ മോഡൽ പേര് നിങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കേണ്ടതുണ്ട്.

കിറ്റിന്റെ പേരും

മാറ്റത്തിന്റെ വിശദാംശങ്ങൾക്കായി ഏത് കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ചു, എന്തൊക്കെ പ്രത്യേക റിയാഗന്റുകൾ ചേർത്തു അല്ലെങ്കിൽ എന്തൊക്കെ പ്രത്യേക പ്രവർത്തനങ്ങൾ ചെയ്തു എന്നൊക്കെ വ്യക്തമായി വിശദീകരിക്കണം, അതുവഴി മറ്റുള്ളവർക്ക് നിങ്ങളുടെ പരീക്ഷണം എളുപ്പത്തിൽ ആവർത്തിക്കാനാകും.

ചില ആളുകൾ പ്രത്യേക സാമ്പിളുകൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കുമ്പോൾ ചില പ്രത്യേക റിയാഗന്റുകൾ ചേർക്കുന്നു, ഇത് തങ്ങളുടെ രഹസ്യ ആയുധമാണെന്നും മറ്റുള്ളവരോട് പറയരുത്.ഇത് രഹസ്യമായി സൂക്ഷിക്കുമ്പോൾ, നിങ്ങളുടെ ലേഖനം തിളങ്ങാനുള്ള അവസരവും അവർക്ക് നഷ്ടപ്പെടും.മിടുക്കനാകരുത്, ശാസ്ത്ര ഗവേഷണത്തിൽ നാട്ടിൻപുറത്തെ പഴയ ഴാങ്ങിനെക്കാൾ സത്യസന്ധത കാണിക്കണം, മിടുക്കനാകണമെങ്കിൽ ലേഖനം നിങ്ങളെ വിഡ്ഢിയാക്കും.

കിറ്റിന്റെ ഉൽപ്പന്ന നമ്പർ ഓർത്തിരിക്കണംനിങ്ങൾ കിറ്റ് ഓർഡർ ചെയ്ത് ലേഖനം എഴുതുമ്പോൾ.കിറ്റിൽ സാധാരണയായി രണ്ട് അക്കങ്ങളുണ്ട്: പൂച്ച-കാറ്റലോഗ് നമ്പർ (ഉൽപ്പന്ന നമ്പർ, ലേഖന നമ്പർ), ലോട്ട് - ഉൽപ്പന്ന ലോട്ട് നമ്പർ ( ഉൽപ്പന്നം ഏത് ബാച്ചിൽ നിന്നാണ് വന്നതെന്ന് സൂചിപ്പിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു).

കൂടാതെ, ബയോകെമിക്കൽ റിയാക്ടറുകൾ ഓർഡർ ചെയ്യുമ്പോൾ CAS നമ്പർ പലപ്പോഴും ഉപയോഗിക്കാറുണ്ട്, ഞാൻ അത് ഒരുമിച്ച് ജനകീയമാക്കും.ഓരോ പുതിയ രാസ മരുന്നിനും അമേരിക്കൻ കെമിക്കൽ സൊസൈറ്റി നൽകുന്ന നമ്പറാണ് CAS നമ്പർ.സാധാരണയായി, മൂന്ന് നമ്പറുകൾ ഒരു ഡാഷ് ഉപയോഗിച്ച് ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു.റുഷൂയിയുടെ CAS നമ്പർ: 7732-18-5.കെമിക്കലുകൾക്ക് പലപ്പോഴും ഒന്നിലധികം അപരനാമങ്ങളുണ്ട്, എന്നാൽ CAS നമ്പർ അദ്വിതീയമാണ്.മരുന്ന് ഓർഡർ ചെയ്യുമ്പോൾ, നിങ്ങൾക്ക് ആദ്യം അതിന്റെ CAS നമ്പർ പരിശോധിക്കാം.

വീടിന് അടുത്ത്, എന്തുകൊണ്ടാണ് ഞങ്ങൾ ഈ കാര്യങ്ങൾ വ്യക്തമായി വിവരിക്കേണ്ടത്?വാസ്തവത്തിൽ, ഇത് ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിന്റെ ഗുണനിലവാരം പരിശോധിക്കാൻ കൂടിയാണ്.ഉപകരണങ്ങളുടെയും കിറ്റുകളുടെയും ഉപയോഗം ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ കൂടുതൽ സ്ഥിരതയുള്ളതാക്കും.സാധാരണ ലബോറട്ടറികളുടെ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ സ്കെയിൽ വലുതല്ല, അത് കിറ്റുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ലഭിക്കും.

DNase അല്ലെങ്കിൽ RNase ചികിത്സയുടെ വിശദാംശങ്ങൾ
ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആറിന്റെ പ്രധാന പ്രശ്നം ഡിഎൻഎ മലിനീകരണം തടയുക എന്നതാണ്, മലിനീകരണം ഉണ്ടെങ്കിൽ പരീക്ഷണം നടത്തരുത്.അതിനാൽ, പരീക്ഷണ പ്രക്രിയയിലെ ഡിഎൻഎ പൂർണ്ണമായും പൂർണ്ണമായും നീക്കം ചെയ്യപ്പെട്ടുവെന്ന് തെളിയിക്കുന്നതിന്, ഡിഎൻഎ പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുന്നതിന് നിങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച പ്രക്രിയ പ്രസ്താവിക്കേണ്ടത് അത്യന്താപേക്ഷിതമാണ്.ഒരു സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.

ആർഎൻഎയുടെയും ഡിഎൻഎയുടെയും സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം
സാധാരണയായി, ഡിഎൻഎ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനുള്ള രീതി, വേർതിരിച്ചെടുത്ത ശേഷം RNA യെ DNase ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുക എന്നതാണ്.എന്നിരുന്നാലും, ഇവ താരതമ്യേന പഴയ രീതികളാണ്.വാണിജ്യ ആർഎൻഎ എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷൻ കിറ്റുകൾക്ക് ഡിഎൻഎസ് ചേർക്കാതെ തന്നെ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ പ്രക്രിയയിൽ ഡിഎൻഎ നീക്കം ചെയ്യാൻ കഴിഞ്ഞു.ഉദാഹരണത്തിന്, ഫോർജീനിൽ നിന്നുള്ള കിറ്റുകളുടെ ഒരു പരമ്പര.

കുറിപ്പ്: ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കുമ്പോൾ ഡിഎൻഎ നീക്കം ചെയ്യുന്നത് വളരെ അപകടകരമായ ഇരുതല മൂർച്ചയുള്ള വാളാണ്, ഇത് ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കലിന്റെ പ്രവർത്തന സമയം ദീർഘിപ്പിക്കുകയും ആർഎൻഎ അപചയത്തിനുള്ള സാധ്യത വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യും.അടിസ്ഥാനപരമായി, ഇത് RNA വിളവും പരിശുദ്ധിയും തമ്മിലുള്ള വ്യാപാരമാണ്.

കൂടാതെ, സിലിക്ക അധിഷ്‌ഠിത അഡ്‌സോർപ്‌ഷൻ കോളത്തിൽ ചേർത്തിരിക്കുന്ന DNase ന്റെ അളവ് വളരെ ചെറുതാണ്, മാത്രമല്ല പ്രഭാവം നേടാൻ ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള DNase ഉപയോഗിക്കേണ്ടതുണ്ട്.ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യാത്ത DNase വേഗത്തിലും പൂർണ്ണമായും ദഹിപ്പിക്കാനാവില്ല.ഇത് വ്യാപാരിയുടെ സാങ്കേതിക നിലവാരത്തിന്റെ ഒരു പരീക്ഷണമാണ്.തീർച്ചയായും, DNase ഇല്ലാതെ ഡിഎൻഎ നീക്കം ചെയ്യാമെന്ന് വീമ്പിളക്കുന്ന കൂടുതൽ വിചിത്രമായ വ്യാപാരികളുണ്ട്.DNase ഇല്ലാതെ ഡിഎൻഎ പൂർണമായും നീക്കം ചെയ്യാമെന്ന് വീമ്പിളക്കുന്ന ഏതൊരാളും ഒരു ഗുണ്ടയാണെന്ന് പറയാം.ഡിഎൻഎ താരതമ്യേന സ്ഥിരതയുള്ള ഒരു ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഘടനയാണ്, അത് സംസാരിച്ച് ചിരിച്ചുകൊണ്ട് മാത്രം ഇല്ലാതാക്കാൻ കഴിയില്ല.

മലിനീകരണ വിലയിരുത്തൽ
മൂല്യനിർണ്ണയ രീതി: ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് കണ്ടെത്തൽ, 1% അഗറോസ്, 6V/cm, 15min, ലോഡിംഗ് 1-3 ul

ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് വിശകലനം
UV സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ചാണ് സാധാരണയായി അളക്കുന്നത്.OD260, OD280, OD230 എന്നീ മൂന്ന് മൂല്യങ്ങളുടെ അർത്ഥം ഞാൻ ആദ്യം ജനകീയമാക്കട്ടെ.
· OD260nm: ഇത് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡിന്റെ ഏറ്റവും ഉയർന്ന ആഗിരണ കൊടുമുടിയുടെ ആഗിരണം തരംഗദൈർഘ്യമാണ്, ഏറ്റവും മികച്ച അളന്ന മൂല്യം 0.1 മുതൽ 1.0 വരെയാണ്.ഇല്ലെങ്കിൽ, പരിധിക്കുള്ളിൽ കൊണ്ടുവരാൻ സാമ്പിൾ നേർപ്പിക്കുക അല്ലെങ്കിൽ കേന്ദ്രീകരിക്കുക.
· OD280nm: പ്രോട്ടീനുകളുടെയും ഫിനോളിക് പദാർത്ഥങ്ങളുടെയും ഏറ്റവും ഉയർന്ന ആഗിരണ കൊടുമുടിയുടെ ആഗിരണം തരംഗദൈർഘ്യമാണിത്.
· OD230nm: കാർബോഹൈഡ്രേറ്റുകളുടെ ഏറ്റവും ഉയർന്ന ആഗിരണ കൊടുമുടിയുടെ ആഗിരണം തരംഗദൈർഘ്യമാണിത്.

അടുത്തതായി, ഓരോ സൂചകത്തിന്റെയും പങ്കിനെക്കുറിച്ച് സംസാരിക്കാം.A260-ന്, ന്യൂക്ലിക് ആസിഡിന്റെ വിളവ് അളക്കാൻ ഇത് ഉപയോഗിക്കാം.എപ്പോൾ OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

പരിശുദ്ധിക്കായി, നമ്മൾ സാധാരണയായി കാണുന്ന അനുപാതങ്ങൾ നോക്കേണ്ടതുണ്ട്: OD260/280, OD260/230.
ശുദ്ധമായ DNA: OD260/280 ഏകദേശം 1.8 ന് തുല്യമാണ്.1.9ൽ കൂടുതലാകുമ്പോൾ ആർഎൻഎ മലിനീകരണമുണ്ടെന്നും 1.6ൽ താഴെയാണെങ്കിൽ പ്രോട്ടീനും ഫിനോൾ മലിനീകരണവും ഉണ്ടെന്നും സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ശുദ്ധമായ RNA: 1.7
·OD260/230: അത് DNA ആയാലും RNA ആയാലും, റഫറൻസ് മൂല്യം 2.5 ആണ്.2.0-ൽ താഴെയാകുമ്പോൾ, പഞ്ചസാര, ഉപ്പ്, ജൈവവസ്തുക്കൾ എന്നിവയുടെ മലിനീകരണം ഉണ്ടെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

ആർഎൻഎ സമഗ്രത

ആർഎൻഎയുടെ സമഗ്രത അളക്കുന്നത് വളരെ പ്രധാനമാണ്.സാധാരണയായി, 28S നും 18S RNA നും ഇടയിലുള്ള തെളിച്ചം രണ്ട് മടങ്ങ് ബന്ധമാണോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ ഒരു RNA ഡീനാറ്ററേഷൻ ജെൽ പരീക്ഷണം നടത്തേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്.മൂന്നാമത്തെ ബാൻഡ് 5S ദൃശ്യമാകുമ്പോൾ, അകശേരുക്കൾ ഒഴികെയുള്ള RNA നശിക്കാൻ തുടങ്ങി എന്നാണ്.

ആർ‌എൻ‌എ ഗുണനിലവാര വിലയിരുത്തലിനുള്ള ഡാറ്റ: മേൽപ്പറഞ്ഞ പരിശോധനകൾക്ക് പുറമേ, ആർ‌എൻ‌എ സമഗ്രതയുടെ കാര്യത്തിൽ കൂടുതൽ വിപുലമായ ഉപകരണ പരിശോധനകളും ഉണ്ട്, എക്‌സ്‌പെരിയോൺ ഓട്ടോമാറ്റിക് ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസ് സിസ്റ്റത്തിന്റെ ആർ‌ക്യുഐ ഇന്റഗ്രിറ്റി ടെസ്റ്റ് പോലെ, ആർ‌എൻ‌എ അദൃശ്യമായി ഡീഗ്രേഡാണോ എന്ന് കണ്ടെത്താനാകും.

ശാസ്ത്രീയ ഗവേഷണത്തിൽ, ടാർഗെറ്റ് ജീനും ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനും തമ്മിലുള്ള താരതമ്യമാണ് ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ.അതിനാൽ, ആർഎൻഎ സാമ്പിൾ സംരക്ഷണം, ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ മുതലായവയിൽ, പ്രാഥമിക ലക്ഷ്യം ആർഎൻഎയുടെ സമഗ്രത ഉറപ്പാക്കുക എന്നതാണ്.

ആർഎൻഎയുടെ സമഗ്രത ടാർഗെറ്റ് ജീനും ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനും തമ്മിലുള്ള സന്തുലിതാവസ്ഥയെ എങ്ങനെ ബാധിക്കുന്നു എന്നത് ചുവടെയുള്ള ചിത്രത്തിൽ നിന്ന് എളുപ്പത്തിൽ മനസ്സിലാക്കാം.അപചയം ജീൻ അപൂർണ്ണതയിലേക്ക് നയിക്കും, അത് ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനിന്റെ അപൂർണ്ണതയായാലും ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ അപൂർണ്ണതയായാലും, അത് ഡാറ്റയിൽ വലിയ സ്വാധീനം ചെലുത്തും.

ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെയും റഫറൻസ് ജീനിന്റെയും സ്‌കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം സത്യമായിരിക്കരുത്

ഇൻഹിബിഷൻ ടെസ്റ്റ് (സിടി മൂല്യം ഉയർന്നതോ കുറഞ്ഞതോ ആയ ഏകാഗ്രതയിലോ മറ്റ് സാഹചര്യങ്ങളിലോ അടിച്ചമർത്തപ്പെട്ടതാണോ എന്ന്)

ഈ കണക്ക് ഉദാഹരണമായി എടുത്താൽ, അഞ്ച് വളവുകളുടെ Ct മൂല്യങ്ങൾ ഇപ്രകാരമാണ്.വളവുകൾക്കിടയിലുള്ള CT മൂല്യങ്ങളുടെ വിതരണം അസമമാണ്, കൂടാതെ Ct മൂല്യങ്ങൾ ഉയർന്നതും താഴ്ന്നതുമായ സാന്ദ്രതയിൽ കാലതാമസം നേരിടുന്നു, ഇത് PCR ഇൻഹിബിഷന്റെ കാര്യമാണ്.

പ്രധാന കാര്യം: ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ പ്രക്രിയയിൽ, തെറ്റിദ്ധാരണകൾ ഉപേക്ഷിച്ച് ശരിയായവ സ്ഥാപിക്കേണ്ടതുണ്ട്.

തെറ്റായ ആശയം ഇതാണ്: ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ വിളവ് മാത്രം പിന്തുടരുന്നു, ആർഎൻഎയുടെ അളവ് എത്ര വലുതാണോ അത്രയും നല്ലത്.വാസ്തവത്തിൽ, നമ്മൾ ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ നടത്തുമ്പോൾ, ജീനുകളുടെ എണ്ണം വളരെ വലുതല്ലെങ്കിൽ, നമുക്ക് കൂടുതൽ ആർഎൻഎ ആവശ്യമില്ല.നിങ്ങൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്ന ആർഎൻഎയുടെ അളവ് ആവശ്യത്തിലേറെയാണ്.

ശരിയായ ആശയം ഇതാണ്:ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ ശുദ്ധി, സമഗ്രത, സ്ഥിരത എന്നിവ പിന്തുടരേണ്ടതാണ്.തുടർന്നുള്ള റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ തടസ്സപ്പെടുന്നില്ലെന്നും ഡാറ്റയെ ഡിഎൻഎ ബാധിക്കില്ലെന്നും പ്യൂരിറ്റി ഉറപ്പാക്കും.സമഗ്രത ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസുകളുടെയും ആന്തരിക റഫറൻസുകളുടെയും ബാലൻസ് ഉറപ്പാക്കുന്നു.സ്ഥിരത സ്ഥിരതയുള്ള സാമ്പിൾ ലോഡിംഗ് ഉറപ്പാക്കുന്നു.

MIQE (4) - റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ
തെറ്റിദ്ധാരണ: ഉയർന്ന സാമ്പിൾ വോള്യം പിന്തുടരൽ.
ശരിയായ ആശയം: സ്ഥിരത (സ്ഥിരത) പിന്തുടരുക, ലോഡ് ചെയ്ത ആർഎൻഎയുടെ അളവ് പരിഗണിക്കാതെ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന്റെ കാര്യക്ഷമത സ്ഥിരമായി തുടരുന്നു, സിഡിഎൻഎയിലെ വ്യത്യാസങ്ങൾ യഥാർത്ഥത്തിൽ എംആർഎൻഎയിലെ വ്യത്യാസങ്ങളെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുമെന്ന് ഉറപ്പാക്കുന്നു.
ഒരു സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ ഈ പ്രക്രിയ വിശദീകരിക്കുന്നു:

റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കാര്യക്ഷമതയുടെ സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം, ശരിയാകരുത്
ഒന്നാമതായി, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രക്രിയയും പിസിആർ പ്രക്രിയയും തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസം നമ്മൾ മനസ്സിലാക്കേണ്ടതുണ്ട്.പിസിആർ ഒന്നിലധികം ചൂടാക്കൽ, അനീലിംഗ് പ്രക്രിയകൾക്ക് വിധേയമാകുന്നു, ടാർഗെറ്റ് ശകലം ഗണ്യമായി വളരുന്നു;റിവേഴ്‌സ് ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്‌ഷന് ഈ പ്രക്രിയ ഇല്ലെങ്കിലും, റിവേഴ്‌സ് ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്ഷൻ യഥാർത്ഥത്തിൽ റിപ്ലിക്കേഷൻ പ്രക്രിയയിൽ, ആർഎൻഎയുടെ നിരവധി കഷണങ്ങൾ പോലെ ഒന്നിൽ നിന്ന് ഒന്നാണെന്ന് നമുക്ക് ഊഹിക്കാം.

സിഡിഎൻഎ വിവരങ്ങളുടെ അത്രയും കഷണങ്ങൾ ലഭിക്കുമെന്നതിനാൽ, അത് ഇപ്പോൾ മനസ്സിലാക്കേണ്ടതാണ്, കാരണം വലുതും ചെറുതുമായ ശകലങ്ങൾ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു, മാത്രമല്ല ഒരു ശകലത്തിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിക്കുക അസാധ്യമാണ്.ആർ‌എൻ‌എയുടെ അളവ് താരതമ്യേന ചെറുതായതിനാൽ, പി‌സി‌ആറിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി ലഭിച്ച സി‌ഡി‌എൻ‌എയുടെ അളവും താരതമ്യേന ചെറുതാണ്, ഇതിന് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഫലമുണ്ട്, അതിനാൽ ഇത് കണ്ടെത്തുന്നത് അടിസ്ഥാനപരമായി അസാധ്യമാണ്.

cDNA ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ഫലങ്ങൾ
രണ്ടാമതായി, മികച്ച രീതിയിൽ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഒറ്റയടിക്ക് നടത്തുന്നു, എന്നാൽ ഒരു കമ്പനിയിൽ നിന്നും റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഈ പ്രഭാവം നേടാൻ കഴിയില്ല.അടിസ്ഥാനപരമായി, മിക്ക റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസുകളുടെയും കാര്യക്ഷമത 30-50% വരെയാണ്.അങ്ങനെയാണെങ്കിൽ, നമുക്ക് താരതമ്യേന സ്ഥിരതയുള്ള റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കാര്യക്ഷമതയാണ്, ചിത്രത്തിൽ കാണാൻ ആഗ്രഹിക്കുന്നത്: 3 RNA-കൾക്ക് 2 cDNA-കൾ, 6 RNA-കൾക്ക് 4 cDNA-കൾ, അതിനാൽ എത്ര സാമ്പിൾ ലോഡ് ചെയ്താലും, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കാര്യക്ഷമത താരതമ്യേന സ്ഥിരതയുള്ളതാണ്.റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കാര്യക്ഷമത അസ്ഥിരവും ഉയർന്ന ഏകാഗ്രത തടസ്സപ്പെടുന്നതുമായ സാഹചര്യം കാണാൻ ഞങ്ങൾ ആഗ്രഹിക്കുന്നില്ല.

അപ്പോൾ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കാര്യക്ഷമത സ്ഥിരതയുള്ളതാണോ എന്ന് എങ്ങനെ പരിശോധിക്കാം?രീതി വളരെ ലളിതമാണ്, നിങ്ങൾ ഒരു താരതമ്യ പരിശോധന നടത്തിയാൽ മതിയാകും: ഒന്ന് RNA ഇരട്ടിയാക്കിയ ശേഷം cDNA-യിലേക്ക് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്യുക, മറ്റൊന്ന് cDNA-യിലേക്ക് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്ത ശേഷം ഇരട്ടിപ്പിക്കൽ നേർപ്പിക്കുക, തുടർന്ന് ലഭിച്ച ചരിവ് സ്ഥിരമാണോ എന്ന് കാണാൻ qPCR ചെയ്യുക.ഒരു മികച്ച വിദ്യാർത്ഥി എന്ന നിലയിൽ, നിങ്ങൾ അത് നിമിഷങ്ങൾക്കുള്ളിൽ മനസ്സിലാക്കണം.താഴെ കാണിച്ചിരിക്കുന്നത് പോലെ:

റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന്റെ കാര്യക്ഷമത സ്ഥിരതയുള്ളതാണോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ RNA, cDNA എന്നിവയുടെ നേർപ്പിക്കൽ
റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റസും കിറ്റും
മികച്ച ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആറിന് എങ്ങനെ മികച്ച റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റസും കിറ്റും ഉണ്ടാകും.റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിനെ ഉറവിടം അനുസരിച്ച് ഏകദേശം രണ്ട് തരങ്ങളായി തിരിച്ചിരിക്കുന്നു, AMV അല്ലെങ്കിൽഎം-എം.എൽ.വി, അവരുടെ പ്രകടനം പട്ടികയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതിന് സമാനമാണ്.

RNase H പ്രവർത്തനം
RNase H എന്നത് Ribonuclease H ആണ്, ചൈനീസ് പേര് ribonuclease H എന്നാണ്, ഇത് DNA-RNA ഹൈബ്രിഡ് ശൃംഖലയിൽ ആർഎൻഎയെ ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യാൻ കഴിയുന്ന ഒരു എൻഡോറിബോ ന്യൂക്ലീസാണ്.സിംഗിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് അല്ലെങ്കിൽ ഡബിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ അല്ലെങ്കിൽ ആർഎൻഎയിൽ ഫോസ്ഫോഡിസ്റ്റർ ബോണ്ടുകളെ ജലവിശ്ലേഷണം ചെയ്യാൻ RNase H-ന് കഴിയില്ല, അതായത്, സിംഗിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് അല്ലെങ്കിൽ ഡബിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് DNA അല്ലെങ്കിൽ RNA-യെ ദഹിപ്പിക്കാൻ അതിന് കഴിയില്ല.സിഡിഎൻഎയുടെ രണ്ടാമത്തെ സ്ട്രോണ്ടിന്റെ സമന്വയത്തിൽ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.

അതൊരു വിചിത്രമായ കാര്യമാണ്.റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിന് RNase H ആക്റ്റിവിറ്റി ഉണ്ടെന്നാണ് ഞങ്ങൾ പറയുന്നത്, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിൽ RNase H അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു എന്നല്ല, RNase H-നെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിൽ നിന്ന് വേർതിരിക്കുന്നത് സാധ്യമായേക്കില്ല, ഒരുപക്ഷേ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിലെ ചില ഗ്രൂപ്പുകളുടെ അനുരൂപമായതിനാലാകാം ഈ പ്രവർത്തനം റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിന് കാരണമാകുന്നത്.

അതിനാൽ, AMV യുടെ ഉയർന്ന റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കാര്യക്ഷമത പരിഗണിക്കാതെ തന്നെ, അതിന്റെ RNase H പ്രവർത്തനം cDNA യുടെ വിളവ് കുറയ്ക്കുന്നു.തീർച്ചയായും, cDNA യുടെ വിളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിലെ RNase H പ്രവർത്തനം ഇല്ലാതാക്കാൻ റീജന്റ് നിർമ്മാതാക്കൾ നിരന്തരം അവരുടെ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുന്നു.
അനീലിംഗ് താപനില

വ്യത്യസ്ത ഊഷ്മാവിൽ ആർഎൻഎയുടെ ദ്വിതീയ ഘടന
വ്യത്യസ്‌ത ഊഷ്മാവിൽ ആർഎൻഎയുടെ ദ്വിതീയ ഘടനയ്‌ക്കായി മുകളിലുള്ള ചിത്രം കാണുക, കൂടാതെ നിർദ്ദിഷ്ട താപനിലയിലും ഉപ്പ് സാന്ദ്രതയിലും ടാർഗെറ്റ് ശകലത്തിന്റെ ദ്വിതീയ ഘടന നിർണ്ണയിക്കാൻ mFold ഓൺലൈൻ ടൂൾ ഉപയോഗിക്കുക.55 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ, ആർഎൻഎയുടെ ദ്വിതീയ ഘടന ഇപ്പോഴും വളരെ സങ്കീർണ്ണമാണ്, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിന് പ്രവർത്തിക്കാൻ കഴിയില്ല, കൂടാതെ 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ് വരെ ദ്വിതീയ ഘടന പൂർണ്ണമായും പരിഹരിക്കാൻ കഴിയില്ല, അതേസമയം AMV, M-MLV എന്നിവയുടെ ഒപ്റ്റിമൽ താപനില ഈ താപനിലയേക്കാൾ വളരെ കുറവാണ്.
എന്തുചെയ്യും?ദ്വിതീയ ഘടന എന്നത് ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ തന്നെ കോംപ്ലിമെന്ററി ജോടിയാക്കലാണ്, ഇത് പ്രൈമറും റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റസും ടെംപ്ലേറ്റും തമ്മിലുള്ള ശക്തമായ മത്സരത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു, ഇത് കുറഞ്ഞ E, മോശം ആവർത്തനക്ഷമത തുടങ്ങിയ പ്രശ്‌നങ്ങളുടെ ഒരു പരമ്പരയ്ക്ക് കാരണമാകുന്നു.

എന്തുചെയ്യും?അനീലിംഗ് താപനില കഴിയുന്നത്ര വർദ്ധിപ്പിക്കുക.

പല റീജന്റ് നിർമ്മാതാക്കളും ജനിതക എഞ്ചിനീയറിംഗ് വഴി അവരുടെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നു.ചിലർ ജിഫാൻ, ഐഡെലൈ എന്നിവ പോലെയുള്ള പ്രതികരണ താപനില വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു, ചിലർ എൻസൈമും ആർഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റും തമ്മിലുള്ള ബന്ധം മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനായി ആർ‌നേസ് എച്ച് എൻസൈമിന്റെ സജീവ ഗ്രൂപ്പിനെ നീക്കംചെയ്യുന്നു.ഉയർന്ന അഫിനിറ്റിക്ക് ദ്വിതീയ ഘടനയെ മത്സരാധിഷ്ഠിതമായി ചൂഷണം ചെയ്യാനും സുഗമമായി വായിക്കാനും കഴിയും, കൂടാതെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന്റെ കാര്യക്ഷമത വളരെയധികം മെച്ചപ്പെടുത്താനും കഴിയും.
പ്രധാന പോയിന്റ്: റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കാര്യക്ഷമതയുടെ സ്ഥിരത പിന്തുടരാൻ വളരെ പ്രധാനമാണ് (എൻസൈമുകൾ കാര്യക്ഷമമായി മാത്രമല്ല, സ്ഥിരതയുള്ളതായിരിക്കണം), പകരം ലോഡ് ചെയ്ത സാമ്പിളിന്റെ അളവിനേക്കാൾ, അത് പ്രത്യേകിച്ച് വലിയ തോതിലുള്ള ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR അല്ലെങ്കിൽ, അത് സാധ്യമല്ല.ഒന്നിലധികം cDNA-കൾ.
വിവിധ നിർമ്മാതാക്കളും സ്ഥിരതയ്ക്കായി ചില ശ്രമങ്ങൾ നടത്തിയിട്ടുണ്ട്.ഉദാഹരണത്തിന്, മിക്ക കമ്പനികളും ഇപ്പോൾ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് കിറ്റായി പാക്കേജ് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്, ഇത് ഒരു നല്ല തിരഞ്ഞെടുപ്പാണ്.
ഉദാഹരണത്തിന്, Foregene ന്റെ RT ഈസി സീരീസ് കിറ്റുകൾ:

ആർടി ഈസി ഐ (ആദ്യ സ്‌ട്രാൻഡ് സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസ് കിറ്റിനുള്ള മാസ്റ്റർ പ്രീമിക്‌സ്)

MIQE (5) - ടാർഗെറ്റ് ജീൻ വിവരങ്ങൾ

മുകളിലെ ചിത്രം വിശദീകരിക്കുന്നു
1. ആവർത്തിച്ചുള്ള പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക് ഈ ജീൻ ഫലപ്രദമാണോ എന്ന് പൊതുവെ ആവർത്തിച്ചുള്ള പരീക്ഷണങ്ങളിലൂടെ സ്ഥിരീകരിക്കാനാകും.
2. ജീൻ ഐഡി, നിങ്ങൾക്കറിയാം.
3. ജീൻ ദൈർഘ്യം, ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ മൊത്തം നീളം തീർച്ചയായും പ്രശ്നമല്ല.പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുമ്പോൾ, മികച്ച ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത ഉറപ്പാക്കാൻ ആംപ്ലിക്കണിന്റെ ദൈർഘ്യം 80-200 ബിപിയ്‌ക്കിടയിലാണെന്ന് ഉറപ്പാക്കുക.
4. സീക്വൻസ് ബ്ലാസ്റ്റ് താരതമ്യ വിവരങ്ങൾ, നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ തടയാൻ ടാർഗെറ്റ് ജീൻ ജീൻബാങ്കിൽ താരതമ്യം ചെയ്യേണ്ടതുണ്ട്.
5. സ്യൂഡോജെനുകളുടെ സാന്നിധ്യം.ഒരു സാധാരണ ജീനിന് സമാനമായ ഒരു ഡിഎൻഎ സീക്വൻസാണ് സ്യൂഡോജെൻ എന്നാൽ അതിന്റെ സാധാരണ പ്രവർത്തനം നഷ്ടപ്പെടുന്നു.യൂക്കറിയോട്ടുകളുടെ മൾട്ടി-ജീൻ കുടുംബത്തിലാണ് ഇത് പലപ്പോഴും നിലനിൽക്കുന്നത്.ഇത് സാധാരണയായി ψ ആണ് പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നത്.കോഡിംഗ് ജീൻ സീക്വൻസിനോട് വളരെ സാമ്യമുള്ള ജീനോമിലെ പ്രവർത്തനരഹിതമായ ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ കോപ്പിയാണിത്., പൊതുവെ ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്യപ്പെടുന്നില്ല, കൂടാതെ വ്യക്തമായ ഫിസിയോളജിക്കൽ അർത്ഥവുമില്ല.
6. എക്സോണുകളുമായും ഇൻട്രോണുകളുമായും ബന്ധപ്പെട്ട പ്രൈമറുകളുടെ സ്ഥാനം.ആദ്യ വർഷങ്ങളിൽ, ഡിഎൻഎ മലിനീകരണത്തിന്റെ പ്രശ്നം ഞങ്ങൾ പരിഹരിച്ചപ്പോൾ, ഞങ്ങൾ പലപ്പോഴും പ്രൈമറുകൾ, എക്സോണുകൾ, ഇൻട്രോണുകൾ എന്നിവയുടെ സ്ഥാനങ്ങളിൽ ശ്രദ്ധ ചെലുത്തിയിരുന്നു, ഡിഎൻഎ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഒഴിവാക്കാൻ ഇൻട്രോണുകളിലുടനീളം പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപന ചെയ്യുന്നതായി പൊതുവെ പരിഗണിച്ചിരുന്നു.ചുവടെയുള്ള ചിത്രം കാണുക: കറുപ്പ് ഇൻട്രോണുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, വിവിധ നീലകൾ എക്സോണുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, പിങ്ക് സാധാരണ പ്രൈമറുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, കടും ചുവപ്പ് ഇൻട്രോൺ-സ്പാനിംഗ് പ്രൈമറുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.

സ്കീമാറ്റിക്, ഒരിക്കലും സത്യമല്ല
ഇത് എന്തൊരു മികച്ച പദ്ധതിയാണെന്ന് തോന്നുന്നു, എന്നാൽ വാസ്തവത്തിൽ, മിക്ക കേസുകളിലും, ട്രാൻസ്-ഇൻട്രോൺ പ്രൈമറുകൾ സങ്കൽപ്പിക്കുന്നത് പോലെ മാന്ത്രികമല്ല, മാത്രമല്ല അവ നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും കാരണമാകും.അതിനാൽ ഡിഎൻഎ മലിനീകരണം തടയാനുള്ള ഏറ്റവും നല്ല മാർഗം ഡിഎൻഎ പൂർണമായും നീക്കം ചെയ്യുക എന്നതാണ്.
7. കൺഫർമേഷൻ പ്രവചനം.ഈ ഉദാഹരണം വീണ്ടും ഉപയോഗിച്ച്, ഒരു പ്രത്യേക താപനിലയിലും ഉപ്പ് സാന്ദ്രതയിലും ടാർഗെറ്റ് ശകലത്തിന്റെ ദ്വിതീയ ഘടന നിർണ്ണയിക്കാൻ mFold ഓൺലൈൻ ടൂൾ ഉപയോഗിക്കുക.

വ്യത്യസ്ത ഊഷ്മാവിൽ ആർഎൻഎയുടെ ദ്വിതീയ ഘടന
ദ്വിതീയ ഘടന എന്നത് ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ തന്നെ പൂരക ജോടിയാക്കലാണ്, ഇത് പ്രൈമറും ടെംപ്ലേറ്റ് ജോടിയാക്കലും തമ്മിൽ ശക്തമായ മത്സരത്തിലേക്ക് നയിക്കും, കൂടാതെ പ്രൈമർ ബൈൻഡിംഗിന്റെ സാധ്യത കുറവാണ്, ഇത് കുറഞ്ഞ E, മോശം ആവർത്തനക്ഷമത തുടങ്ങിയ പ്രശ്‌നങ്ങളുടെ ഒരു പരമ്പരയ്ക്ക് കാരണമാകുന്നു.സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ പ്രവചനത്തിലൂടെ, ദ്വിതീയ ഘടന പ്രശ്‌നമില്ലെങ്കിൽ, അത് മികച്ചതായിരിക്കും.ഉണ്ടെങ്കിൽ, ഈ പ്രശ്നം എങ്ങനെ പരിഹരിക്കാമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫോളോ-അപ്പ് ലേഖനം പ്രത്യേകം ചർച്ച ചെയ്യും.

MIQE (6)-qPCR ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ

ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആറിനായി, എല്ലാ ദിവസവും നിങ്ങൾ ആദ്യം ബുദ്ധിമുട്ടുന്നത് ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കലാണ്, രണ്ടാമത്തേത് പ്രൈമർ ഡിസൈൻ ആയിരിക്കാം.
ഒന്നാമതായി, MIQE ചെക്ക്‌ലിസ്റ്റ് അനുസരിച്ച് പ്രൈമർ ഡിസൈനിനെക്കുറിച്ചുള്ള നിയമങ്ങൾ ഞങ്ങൾ ഇപ്പോഴും പരിശോധിക്കുന്നു.ഇത് വളരെ ലളിതമാണ്, അഴിമതിക്കാർക്ക് ചിരിക്കാൻ കഴിയും, നമുക്ക് അത് ഒരു വാചകത്തിൽ അവസാനിപ്പിക്കാം: പ്രൈമർ പ്രോബിന്റെ ക്രമവും സ്ഥാനവും പരിഷ്ക്കരണ രീതിയും കണ്ടെത്തുക.പ്രൈമർ പ്യൂരിഫിക്കേഷൻ രീതിക്ക്, പ്രൈമർ സിന്തസിസ് നിലവിൽ വളരെ വിലകുറഞ്ഞതാണ്, qPCR PAGE-നും അതിനുമുകളിലുള്ള ശുദ്ധീകരണ രീതികൾക്കും യോഗ്യമാണ്, കൂടാതെ സിന്തസിസ് ഉപകരണത്തിന്റെ വിവരങ്ങൾ പ്രധാനമല്ല.പലരും പതിറ്റാണ്ടുകളായി പ്രൈമറുകൾ ചെയ്യുന്നു, സിന്തസൈസർ ABI3900 ആണെന്ന് അറിയില്ല.
പ്രൈമർ ഡിസൈനിന്റെ തത്ത്വങ്ങൾ സംബന്ധിച്ച്, നിങ്ങൾ അവ മനഃപാഠമാക്കേണ്ടതില്ല, കാരണം മിക്ക പ്രൈമർ ഡിസൈൻ സോഫ്‌റ്റ്‌വെയറുകൾക്കോ ​​ഓൺലൈൻ ടൂളുകൾക്കോ ​​ഈ പ്രശ്‌നങ്ങൾ പരിഹരിക്കാൻ കഴിയും (ശുപാർശ ചെയ്‌ത ഓൺലൈൻ ടൂൾ Primer3.ut.ee/), കൂടാതെ പ്രൈമർ ഡിസൈനിന്റെ 99.999% സ്വമേധയാ ചെയ്യപ്പെടുന്നില്ല, നോക്കൂ, രചയിതാവ് ചിലപ്പോൾ നൂറുകണക്കിന് പ്രൈമറുകൾ ഒരു ദിവസം രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുന്നു, നിങ്ങൾ ഓരോന്നായി വായിക്കുകയാണെങ്കിൽ.
പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്തതിന് ശേഷം ഇനിപ്പറയുന്ന പോയിന്റുകൾ പരിശോധിക്കുക:
1. ഡിസൈൻ പ്രൈമറുകൾ 3′ അവസാനത്തോട് അടുക്കുന്നു: സിഡിഎൻഎ ഫസ്റ്റ്-സ്ട്രാൻഡ് സിന്തസിസിനായി ഒലിഗോ ഡിടി പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന സാഹചര്യത്തിൽ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കാര്യക്ഷമതയും ആർഎൻഎ സമഗ്രതയും കണക്കിലെടുത്ത്, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിന് രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത പ്രൈമറുകൾ 3′ അറ്റത്തിനടുത്തായി രൂപകൽപ്പന ചെയ്യേണ്ടതുണ്ട്.ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ വിശദീകരിക്കാൻ ഒരു ചിത്രം ഉപയോഗിക്കുക (ഇത് മനസ്സിലാക്കാൻ ഒരു മാർഗവുമില്ല):

എന്തുകൊണ്ടാണ് പ്രൈമറുകൾ 3′ അവസാനത്തോട് ചേർന്ന് രൂപകൽപ്പന ചെയ്യേണ്ടത്, അത് സത്യമായിരിക്കരുത്
2. TM മൂല്യം: Tm മൂല്യം 55-65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലാണ് (കാരണം എക്സോന്യൂക്ലീസ് പ്രവർത്തനം ഏറ്റവും ഉയർന്നത് 60 ° C ആണ്), കൂടാതെ GC ഉള്ളടക്കം 40%-60% ആണ്.
3. ബ്ലാസ്റ്റ്: ജീനോമിന്റെ നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഒഴിവാക്കാൻ, അനുബന്ധ പരിശോധനയ്ക്കായി ബ്ലാസ്റ്റ് ഉപയോഗിക്കണം.

MIQE(7)-qPCR പ്രക്രിയ

1. qPCR കിറ്റ്
MIQE യുടെ ആവശ്യകതകൾ അനുസരിച്ച്, പിസിആർ പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിന്റെ കോൺഫിഗറേഷൻ, ഏത് കിറ്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നു, ആരാണ് നിർമ്മാതാവ്, പ്രതികരണ സംവിധാനം എത്ര വലുതാണ്, ഡൈ രീതിയോ അന്വേഷണ രീതിയോ, PCR പ്രോഗ്രാം ക്രമീകരണങ്ങൾ എന്നിവ ഉൾപ്പെടെ ലേഖനത്തിലെ പൂർണ്ണമായ പ്രതികരണ സാഹചര്യങ്ങൾ ഞങ്ങൾ വ്യക്തമായി വിവരിക്കണം.കിറ്റ് തിരഞ്ഞെടുത്തിരിക്കുന്നിടത്തോളം, മുകളിൽ പറഞ്ഞിരിക്കുന്ന വിവരങ്ങൾ അടിസ്ഥാനപരമായി നിർണ്ണയിക്കപ്പെടുന്നുവെന്ന് വെറ്ററൻ ഡ്രൈവർമാർ തീർച്ചയായും കണ്ടെത്തും.
നിലവിൽ, ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ കിറ്റുകളുടെ നിർമ്മാണവും ഉൽപ്പാദനവും വളരെ പക്വമായ ഒരു സാങ്കേതികവിദ്യയാണ്.നിങ്ങൾ വളരെ മോശം നിർമ്മാതാക്കളെ തിരഞ്ഞെടുക്കാത്തിടത്തോളം, പ്രശ്‌നങ്ങളുടെ സംഭാവ്യത ഉയർന്നതല്ല, എങ്കിലും ഞങ്ങൾ നിങ്ങളുമായി ചില പോയിന്റുകൾ പങ്കിടാൻ ആഗ്രഹിക്കുന്നു:
ഹോട്ട്-സ്റ്റാർട്ട് ടാക്ക് എൻസൈം:പിസിആറിന്റെ ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട ഭാഗം ഹോട്ട്-സ്റ്റാർട്ട് ടാക് എൻസൈം ആണ്.വിപണിയിലെ ഹോട്ട്-സ്റ്റാർട്ട് എൻസൈമുകളെ സാധാരണയായി രണ്ട് തരങ്ങളായി തിരിച്ചിരിക്കുന്നു, ഒന്ന് രാസപരമായി പരിഷ്കരിച്ച ഹോട്ട്-സ്റ്റാർട്ട് എൻസൈം (നിങ്ങൾക്ക് ഇത് പാരഫിൻ എംബഡിംഗ് ആയി സങ്കൽപ്പിക്കാം), മറ്റൊന്ന് ആന്റിബോഡി മോഡിഫിക്കേഷനുള്ള (ആന്റിജൻ-ആന്റിബോഡി ബൈൻഡിംഗ്) ഹോട്ട്-സ്റ്റാർട്ട് എൻസൈമാണ്.രാസമാറ്റം ചൂടുള്ള എൻസൈമുകളുടെ ആദ്യകാല മാർഗമാണ്.ഒരു നിശ്ചിത ഊഷ്മാവ് എത്തുമ്പോൾ, എൻസൈം അതിന്റെ പ്രവർത്തനം പുറത്തുവിടും.ആന്റിബോഡി പരിഷ്കരിച്ച ഹോട്ട്-സ്റ്റാർട്ട് എൻസൈം എൻസൈമിന്റെ പ്രവർത്തനത്തെ തടയാൻ ജൈവ രീതികൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഒരു നിശ്ചിത ഊഷ്മാവിൽ എത്തുമ്പോൾ, ആൻറിബോഡി ഒരു പ്രോട്ടീനായി നിർജ്ജീവമാക്കപ്പെടുകയും നിർജ്ജീവമാക്കപ്പെടുകയും ചെയ്യും, എൻസൈം പ്രവർത്തനം പ്രവർത്തനക്ഷമമാക്കും.

എന്നിരുന്നാലും, ഇതിന്റെ പ്രയോജനം എന്താണ്?ഈ സാഹചര്യത്തിലാണ്, ആന്റിബോഡി പരിഷ്കരിച്ച എൻസൈമുകളുടെ പ്രകാശന പ്രവർത്തനം രാസപരമായി പരിഷ്കരിച്ച എൻസൈമുകളേക്കാൾ വേഗത്തിലാണ്, അതിനാൽ സെൻസിറ്റിവിറ്റിയുടെ കാര്യത്തിൽ, ആന്റിബോഡി-പരിഷ്കരിച്ച എൻസൈമുകൾക്ക് ഒരു ചെറിയ നേട്ടമുണ്ട്, അതിനാൽ വിപണിയിലെ കിറ്റുകളിൽ അടിസ്ഥാനപരമായി രാസപരമായി പരിഷ്കരിച്ച എൻസൈമുകളൊന്നുമില്ല.ഉണ്ടെങ്കിൽ, ഈ നിർമ്മാതാവിന്റെ സാങ്കേതികവിദ്യ ഇപ്പോഴും സഹസ്രാബ്ദത്തിന്റെ കാലഘട്ടത്തിൽ കുടുങ്ങിക്കിടക്കുകയാണ്.
മഗ്നീഷ്യം അയോണിന്റെ സാന്ദ്രത:PCR പ്രതികരണത്തിൽ മഗ്നീഷ്യം അയോൺ സാന്ദ്രത വളരെ പ്രധാനമാണ്.ഉചിതമായ മഗ്നീഷ്യം അയോൺ സാന്ദ്രത ടാക് എൻസൈമിന്റെ പ്രവർത്തനത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കും.സാന്ദ്രത വളരെ കുറവാണെങ്കിൽ, എൻസൈം പ്രവർത്തനം ഗണ്യമായി കുറയും;സാന്ദ്രത വളരെ കൂടുതലാണെങ്കിൽ, എൻസൈം-കാറ്റലൈസ്ഡ് നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വർദ്ധിപ്പിക്കും.മഗ്നീഷ്യം അയോണുകളുടെ സാന്ദ്രത പ്രൈമറുകളുടെ അനീലിംഗ്, ടെംപ്ലേറ്റിന്റെയും പിസിആർ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെയും ഉരുകൽ താപനില എന്നിവയെ ബാധിക്കും, അതുവഴി ആംപ്ലിഫൈഡ് ശകലങ്ങളുടെ വിളവ് ബാധിക്കും.മഗ്നീഷ്യം അയോണുകളുടെ സാന്ദ്രത സാധാരണയായി 25mM-ൽ നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നു.തീർച്ചയായും, ഒരു നല്ല കിറ്റിന്, മഗ്നീഷ്യം അയോണുകളുടെ സാന്ദ്രത നന്നായി നിയന്ത്രിക്കണം.ചില വ്യാപാരികൾ മഗ്നീഷ്യം അയോൺ ചെലേറ്റിംഗ് ഏജന്റ് റിയാക്ടറിലേക്ക് ചേർക്കുന്നു, ഇത് മഗ്നീഷ്യം അയോൺ സാന്ദ്രതയുടെ യാന്ത്രിക ക്രമീകരണത്തിന്റെ പ്രഭാവം കൈവരിക്കും.
ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈ കോൺസൺട്രേഷൻ:നമ്മൾ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന SYBR ഗ്രീൻ ആയ ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈ, പ്രധാനമായും ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎയുടെ മൈനർ ഗ്രോവുമായി ബന്ധിപ്പിച്ച് ഫ്ലൂറസെൻസ് ഉണ്ടാക്കുന്നു, കാരണം ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎയുമായി ഡൈ ബൈൻഡിംഗ് നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആണ്. പശ്ചാത്തല സിഗ്നൽ.
PS: ലൈറ്റ് സെൻസിറ്റീവ് പ്രോപ്പർട്ടികൾ കാരണം, വിപണിയിലെ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ സാധാരണയായി ബ്രൗൺ അതാര്യമായ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബുകളിലാണ് (ചുവടെയുള്ള ചിത്രത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നത് പോലെ) പാക്കേജ് ചെയ്യുന്നത്.എന്നിരുന്നാലും, ഇത് ഒരു പ്രശ്നം നേരിടും.സാമ്പിൾ ചെയ്യുമ്പോൾ ദ്രാവകം വലിച്ചെടുക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് കാണാൻ പ്രയാസമാണ്.ഇക്കാര്യത്തിൽ, Qingke തീർച്ചയായും ഏറ്റവും ഉപയോക്തൃ-സൗഹൃദമാണ് (ചുവടെയുള്ള ചിത്രത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നത് പോലെ), കൂടാതെ സുതാര്യമായ ട്യൂബ് ഒരു അതാര്യമായ ടിൻ ബാഗിൽ പാക്ക് ചെയ്തിരിക്കുന്നു.വെളിച്ചം ഒഴിവാക്കാനും സാമ്പിൾ എടുക്കാനുമുള്ള സൗകര്യം കണക്കിലെടുത്ത് ഒരു ടിൻ ബാഗിൽ ഇടുക.നിങ്ങൾ ശരിയായ ഉൽപ്പന്ന നമ്പർ തിരഞ്ഞെടുക്കണം.TSE204 ഒരു സൂപ്പർ ചെലവ് കുറഞ്ഞ നിലനിൽപ്പാണ്, അത് പുല്ല് നടാൻ എന്നെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു.

ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈയുടെ സാന്ദ്രതയും വളരെ പ്രധാനമാണ്.ഏകാഗ്രത വളരെ കുറവാണെങ്കിൽ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ് പിന്നീടുള്ള ഘട്ടത്തിൽ ഉയരുകയില്ല, അത് പൂർണ്ണവുമല്ല;സാന്ദ്രത വളരെ കൂടുതലാണെങ്കിൽ, അത് ശബ്ദ തടസ്സത്തിന് കാരണമാകും.ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ പ്രധാനമായും സിടി മൂല്യത്തെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നതിനാൽ, ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈയുടെ സാന്ദ്രത ശരിയായി ക്രമീകരിച്ചില്ലെങ്കിൽ, താഴ്ന്ന പോയിന്റ് ഉയർന്ന പോയിന്റിനേക്കാൾ മികച്ചതാണ്.തീർച്ചയായും, അനുയോജ്യമായ ഡൈ കോൺസൺട്രേഷൻ മികച്ചതാണ്.

റോക്സ്: ROX ഡൈകൾ നന്നായി ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നൽ പിശകുകൾ പരിഹരിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു.ചില ഉപകരണ നിർമ്മാതാക്കൾക്ക് കാലിബ്രേഷൻ ആവശ്യമാണ്, മറ്റുള്ളവ അങ്ങനെ ചെയ്യില്ല.ഉദാഹരണത്തിന്, തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്കിന്റെ റിയൽ ടൈം PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉപകരണത്തിന്റെ ഉപയോഗത്തിന് സാധാരണയായി 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus മുതലായവ ഉൾപ്പെടെയുള്ള കാലിബ്രേഷൻ ആവശ്യമാണ്. പൊതു കിറ്റ് നിർദ്ദേശങ്ങൾ അത് വിവരിക്കും.
ഫോർജീന്റെ qPCR മിക്സിൽ ROX ഡൈയും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, ഇത് വിവിധ മോഡലുകളിൽ ഉപയോഗിക്കാൻ സൗകര്യപ്രദമാണ്.

തത്സമയ പിസിആർ കിറ്റ്-തഖ്മാൻ

ദുർബലമായ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ട് ചികിത്സ: ദുർബലമായ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകളുടെ ചികിത്സ താരതമ്യേന സാങ്കേതിക കാര്യമാണ്.പല കിറ്റുകളുടെയും മാനുവലുകൾ ഒന്നും വായിച്ചിട്ടില്ല, എന്നാൽ അവരിൽ ആരും ഈ വിഷയം പരാമർശിച്ചിട്ടില്ല.വാസ്തവത്തിൽ, അത് വളരെ പ്രധാനമാണ്.അടിസ്ഥാനങ്ങളുടെ സംയോജനം പ്രധാനമായും ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകളുടെ ശക്തിയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.ശക്തമായ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകൾ സാധാരണ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനാണ്, ദുർബലമായ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകൾ നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷനിലേക്ക് നയിക്കുന്നു.ദുർബലമായ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകൾ നന്നായി ഇല്ലാതാക്കാൻ കഴിയുന്നില്ലെങ്കിൽ, നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഒഴിവാക്കാനാവില്ല.രചയിതാവിന്റെ പരിധിയിൽ, കുറച്ച് കമ്പനികൾ മാത്രമേ ഈ പ്രശ്നം ശ്രദ്ധിച്ചിട്ടുള്ളൂ.നിങ്ങൾ കിറ്റ് വാങ്ങുമ്പോൾ, നിങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുക്കാൻ ആഗ്രഹിക്കുന്ന കിറ്റിന് ഇക്കാര്യത്തിൽ ഒരു പരിഹാരം ആലോചിച്ചിട്ടുണ്ടോ എന്ന് നിങ്ങൾക്ക് റഫർ ചെയ്യാം.

പ്രതികരണത്തിന്റെ അളവ്: 20-50ul സിസ്റ്റം കൂടുതൽ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്നു, ചെറിയ വോള്യങ്ങൾ പിശകുകൾ ഉണ്ടാക്കാൻ സാധ്യതയുണ്ട്.പൊതുവായി പറഞ്ഞാൽ, കിറ്റ് നിർദ്ദേശങ്ങൾ PCR പ്രതികരണ വോള്യങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യും.മിടുക്കരായിരിക്കരുത്, ചെലവ് ലാഭിക്കാൻ ചെറിയ വോള്യങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുക.ലക്ഷ്യം.വ്യാപാരികൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്ന വോളിയം യഥാർത്ഥത്തിൽ പരിശോധിച്ചു, ചെറിയ വോള്യങ്ങൾ മൂലമുണ്ടാകുന്ന പിശകുകളുടെ പ്രശ്നം പരിഹരിക്കാൻ അവർക്ക് കഴിയില്ലായിരിക്കാം.
2. ട്യൂബ് പ്ലേറ്റിന്റെ നിർമ്മാതാവും ലേഖന നമ്പറും
ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആറിന്റെ തത്വം എല്ലാവർക്കും അറിയാം.ഫ്ലൂറസെൻസ് ശേഖരണം പ്രധാനമായും PCR ട്യൂബ് ക്യാപ്സ് വഴിയാണ് നടത്തുന്നത്.പിസിആർ ഉപഭോഗവസ്തുക്കൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുമ്പോൾ, രണ്ട് പോയിന്റുകൾ ശ്രദ്ധിക്കുക: നല്ല ലൈറ്റ് ട്രാൻസ്മിഷൻ, ഉപകരണത്തിന് അനുയോജ്യം.പൊതുവായി പറഞ്ഞാൽ, മുഖ്യധാരാ ബ്രാൻഡുകളുടെ ബോർഡുകളും ട്യൂബുകളും മികച്ചതാണ്, എന്നാൽ പൊരുത്തപ്പെടുത്തലിന്റെ കാര്യത്തിൽ നിങ്ങൾ ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം തിരഞ്ഞെടുക്കണം, അല്ലാത്തപക്ഷം നിങ്ങൾക്ക് ഉപകരണം ഉപയോഗിക്കാൻ കഴിയില്ല.

4. ഉയർന്ന തലത്തിലുള്ള അറിവ്

MIQE (8)-qPCR മൂല്യനിർണ്ണയം
ഇതാണ് qPCR-ന്റെ മുൻ‌ഗണന!എത്രയോ വീരന്മാർ ഇവിടെ മണലിൽ വീണിട്ടുണ്ട്.തീർച്ചയായും, നിങ്ങൾ ഭാഗ്യവാനായിരിക്കാനും സാധ്യതയുണ്ട്, നിങ്ങൾ പഠിച്ച ജീനുകൾ ലളിതമാണ്, അതിനാൽ നിങ്ങൾ കാറ്റിനൊപ്പം ഐസ് ഗുഹയിലൂടെ ഒഴുകി.qPCR-ന്റെ സ്ഥിരീകരണ വിവരങ്ങൾ ഡാറ്റയുടെ വിശ്വാസ്യത പരിശോധിക്കാൻ ഉദ്ദേശിച്ചുള്ളതാണ്.ആവശ്യമായ സ്ഥിരീകരണ വിവരങ്ങൾ ഞങ്ങൾ ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ പട്ടികപ്പെടുത്തുന്നു:

1. സ്പെസിഫിസിറ്റി ടെസ്റ്റ്
ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ചിത്രം ഒരൊറ്റ ബാൻഡാണോ എന്ന് പരിശോധിച്ച് ടാർഗെറ്റ് ജീൻ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ പ്രത്യേകത പരിശോധിക്കുന്നു;ക്രമപ്പെടുത്തൽ സ്ഥിരീകരണം;പീക്ക് മാപ്പ് ഒറ്റപ്പെട്ടതാണോ എന്നറിയാൻ ഉരുകുന്ന വക്രം;എൻസൈം ദഹന പരിശോധനയും മറ്റ് രീതികളും.
ഇവിടെ, ഞങ്ങൾ ടിയിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിക്കുന്നുവക്രങ്ങൾ ഉരുകുന്ന രീതി ഉപയോഗിച്ച് നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ വിശകലനം.പൊതുവായി പറഞ്ഞാൽ, ഞങ്ങൾ പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുമ്പോൾ, ഉൽപ്പന്ന ശകലത്തിന്റെ വലുപ്പം 80-200bp പരിധിയിലായിരിക്കണം, ഇത് PCR ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ ദ്രവീകരണ താപനില 80-85 °C പരിധിയാക്കുന്നു.അതിനാൽ, വിവിധ കൊടുമുടികൾ ഉണ്ടെങ്കിൽ, മറ്റ് നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ഉണ്ടായിരിക്കണം;കൊടുമുടി 80 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ താഴെയാണെങ്കിൽ, അത് പൊതുവെ പ്രൈമർ ഡൈമർ ആയി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു;85 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിനു മുകളിലാണ് കൊടുമുടി ദൃശ്യമാകുന്നതെങ്കിൽ, അത് ഡിഎൻഎ മലിനീകരണമോ വലിയ ശകലങ്ങളുടെ കൂടുതൽ വ്യക്തമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷനോ ആയി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു.
ശ്രദ്ധിക്കുക: ചിലപ്പോൾ 80 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഒരൊറ്റ കൊടുമുടി മാത്രമേ ഉണ്ടാകൂ.ഈ സമയത്ത്, ഈ ആശയം പാലിക്കേണ്ടതുണ്ട്.ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഫലങ്ങളെല്ലാം പ്രൈമർ ഡൈമറുകളാകാൻ സാധ്യതയുണ്ട്.

സാധാരണ ഉരുകൽ വളവ് (നിർദ്ദിഷ്‌ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഇല്ലാത്ത ഒറ്റ കൊടുമുടി)

പ്രശ്നകരമായ ഉരുകൽ വക്രം (വ്യാജ കൊടുമുടികളുടെ നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ)
【കേസ് വിശകലനം】

ഒരു പ്രധാന കൊടുമുടിയുണ്ട്, പക്ഷേ പ്രൈമർ ഡൈമർ ഗുരുതരമാണ്
ചുവടെയുള്ള ചിത്രത്തിലെ സിംഗിൾ-പീക്ക് മെൽറ്റിംഗ് കർവ് നിങ്ങളുടെ കണ്ണുകളെ എളുപ്പത്തിൽ വഞ്ചിക്കും, ഇത് ഒരു തികഞ്ഞ പരീക്ഷണമാണെന്ന് കരുതി, പക്ഷേ ഫലം പൂർണ്ണമായും തെറ്റാണ്.ഈ സമയത്ത്, നാം ഉരുകുന്ന താപനില നോക്കണം.ഏറ്റവും ഉയർന്ന താപനില 80 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിനു താഴെയാണ്, ഇത് പൂർണ്ണമായും പ്രൈമർ-ഡൈമർ ആണ്.

ടാർഗെറ്റ് ശകലമില്ല, എല്ലാ പ്രൈമർ ഡൈമറുകളും
ഇവിടെ, എന്റെ സഹോദരന് നിർത്താൻ കഴിയില്ല.താഴെ കൊടുത്തിരിക്കുന്ന ചിത്രം മൊബൈൽ ഫോണിൽ എടുത്ത ഫോട്ടോ ആണ് ഒരു തെണ്ടി എനിക്ക് അയച്ചു തന്നത്.അദ്ദേഹം ഉപയോഗിച്ച റിയാക്ടറുകളെല്ലാം വ്യവസായത്തിൽ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രാൻഡുകളാണ്.ഒരു ടി-പ്രിഫിക്സ് ബ്രാൻഡിൽ നിന്ന് മറ്റൊരു ടി-പ്രിഫിക്സ് ബ്രാൻഡിലേക്ക് അദ്ദേഹം മാറി.നിങ്ങൾ ഇതിനകം ഊഹിച്ചുവെന്ന് ഞാൻ കരുതുന്നു.ആ സ്‌കാംബാഗ് എന്നോട് നിലവിളിച്ചു: “ആദ്യ ചിത്രത്തിൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന റീജന്റ് വളരെ മികച്ചതാണ്, മാത്രമല്ല കൊടുമുടി ഒറ്റയ്ക്കാണ്.പിന്നീട്, നിങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്‌ത റീജന്റ് ഉപയോഗിച്ചതിന് ശേഷം, അത് മിക്സഡ് പീക്കുകളുള്ള രണ്ടാമത്തെ ചിത്രം പോലെയാകും.നീ എന്നെ ദുഖിതയാക്കി."
രണ്ട് ഗ്രാഫുകളും വേർതിരിക്കുക.ഒറ്റനോട്ടത്തിൽ ഒരാൾക്ക് ഒരൊറ്റ കൊടുമുടിയും മറ്റൊന്ന് ഇരട്ട കൊടുമുടിയുമാണ്.അസംബന്ധം, ഒരൊറ്റ കൊടുമുടി തീർച്ചയായും നല്ലതാണ്.അത് സത്യമാണോ?
Dou E യെക്കാൾ മോശം, ഞാൻ താഴെയുള്ള ചിത്രത്തിൽ രണ്ട് ചിത്രങ്ങൾ ഇട്ടാൽ, നിങ്ങൾക്ക് പെട്ടെന്ന് മനസ്സിലാകും.വാസ്‌തവത്തിൽ, ഇത്തരത്തിലുള്ള ചിത്രങ്ങളാൽ നമ്മൾ എളുപ്പത്തിൽ തളർന്നുപോകുന്നു.സൂക്ഷ്മമായ വിശകലനത്തിന് ശേഷം, ഞങ്ങൾ ഇത് കണ്ടെത്തി: ആദ്യത്തെ ചിത്രത്തിന്റെ കൊടുമുടി 75 ° C ആണ്, ഇത് പൂർണ്ണമായും പ്രൈമർ ഡൈമർ ആണ്;രണ്ടാമത്തെ ചിത്രത്തിൻറെ കൊടുമുടി 75°C ലും 82°C ലും ദൃശ്യമാകുന്നു, കുറഞ്ഞത് അവിടെ ഉൽപ്പന്നം ദൃശ്യമാകുന്നു.

വിദ്യാർത്ഥികളിൽ നിന്നുള്ള ഫീഡ്ബാക്ക് ചിത്രങ്ങൾ
അതിനാൽ അടിസ്ഥാന പ്രശ്നം റിയാക്ടറുകളുടെ പ്രശ്നമല്ല, മറിച്ച് പ്രൈമർ ഡിസൈനിന്റെ പ്രശ്നമാണ്.അതേസമയം, ചില വലിയ ബ്രാൻഡുകൾ ഇരുമ്പ് ഗുണനിലവാരമുള്ളതല്ലെന്ന് ഇത് തെളിയിക്കുന്നു, കൂടാതെ എന്റെ സഹോദരൻ മുമ്പ് പറഞ്ഞതും ഇത് തെളിയിക്കുന്നു: നിങ്ങളുടെ ലേഖനത്തെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നത് റീജന്റ് ബ്രാൻഡല്ല.നിങ്ങളുടെ ലേഖനമാണ് റിയാജന്റുകളുടെ ബ്രാൻഡ് ഉയർത്തിയത്.വെറുതെ സങ്കൽപ്പിക്കുക, സ്‌കംബാഗ് റിയാക്ടറുകളെ മാറ്റിയില്ലെങ്കിൽ, തെറ്റായ ഡാറ്റ ജേണലിലേക്ക് അയയ്‌ക്കും, സംഭവിക്കുന്നത് ഒരു ദുരന്തമായിരിക്കും.
2. ശൂന്യ നിയന്ത്രണത്തിന്റെ Ct മൂല്യം
വിശദീകരിക്കരുത്, ബ്ലാങ്ക് കൺട്രോളിന് Ct മൂല്യമുണ്ടെങ്കിൽ അത് മലിനീകരണമല്ലേ?എന്നിരുന്നാലും, ഏത് ശൂന്യ നിയന്ത്രണത്തിനാണ് Ct മൂല്യമുള്ളതെന്ന് നിങ്ങൾ ഇപ്പോഴും മനസ്സിലാക്കേണ്ടതുണ്ട്.NTC ആണെങ്കിൽ, reagent contamination പോലെയുള്ള വിദേശ DNA ഉണ്ടെന്നാണ് അർത്ഥം.NRT ആണെങ്കിൽ, വേർതിരിച്ചെടുത്ത RNA യിൽ DNA മലിനീകരണം ഉണ്ടെന്നാണ് അർത്ഥമാക്കുന്നത്.
3. സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ്
ചരിവും കണക്കുകൂട്ടൽ ഫോർമുലയും ഉൾപ്പെടെ, PCR കാര്യക്ഷമത ഫോർമുലയിലൂടെ കണക്കാക്കാം.ഒരു മികച്ച പരീക്ഷണത്തിന് 3.32-നെ സമീപിക്കാൻ സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവിന്റെ ചരിവും 0.9999-നെ സമീപിക്കാൻ R²-ഉം ആവശ്യമാണ്.
4. ലീനിയർ ഡൈനാമിക് ശ്രേണി
പ്രതികരണത്തിന്റെ ചലനാത്മക ശ്രേണി രേഖീയമാണ്.സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് സൃഷ്ടിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന ടെംപ്ലേറ്റ് അനുസരിച്ച്, ഡൈനാമിക് ശ്രേണിയിൽ കുറഞ്ഞത് 5 കോൺസൺട്രേഷൻ ഗ്രേഡിയന്റുകളെങ്കിലും ഉൾപ്പെടുത്തണം, കൂടാതെ ഉയർന്ന കോൺസൺട്രേഷൻ ഗ്രേഡിയന്റുകളിലും കുറഞ്ഞ കോൺസൺട്രേഷൻ ഗ്രേഡിയന്റുകളിലും Ct മൂല്യങ്ങളുടെ മാറ്റം ശ്രദ്ധിക്കുക.
5. കണ്ടെത്തൽ കൃത്യത
qPCR ഫലങ്ങളിലെ മാറ്റങ്ങൾ, അതായത്, മോശം ആവർത്തനക്ഷമത, അതായത്, മോശം കൃത്യത, താപനില, ഏകാഗ്രത, പ്രവർത്തനം എന്നിവയുൾപ്പെടെ പല ഘടകങ്ങളാൽ സംഭവിക്കുന്നു.പകർപ്പുകളുടെ എണ്ണം കുറയുന്നതിനനുസരിച്ച് qPCR പ്രിസിഷൻ പൊതുവെ നിയന്ത്രിക്കാനാകുന്നില്ല.പരീക്ഷണാത്മക വ്യതിയാനത്തിനുള്ളിൽ, ഈ സാങ്കേതിക വ്യതിയാനം ജീവശാസ്ത്രപരമായ വ്യതിയാനത്തിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായിരിക്കണം, കൂടാതെ ജീവശാസ്ത്രപരമായ പകർപ്പുകൾക്ക് ഗ്രൂപ്പുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ചികിത്സകൾ തമ്മിലുള്ള qPCR ഫലങ്ങളിലെ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകൾ നേരിട്ട് പരിഹരിക്കാൻ കഴിയും.പ്രത്യേകിച്ച് ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് പരിശോധനകൾക്ക്, സൈറ്റുകളിലും ഓപ്പറേറ്റർമാരിലുമുള്ള ഏറ്റവും മികച്ച ഇന്റർ-അസ്സേ പ്രിസിഷൻ (ആവർത്തനക്ഷമത) റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യണം.
6. കണ്ടെത്തൽ കാര്യക്ഷമതയും LOD (മൾട്ടിപ്ലക്‌സ് qPCR-ൽ)
കണ്ടെത്തിയ 95% പോസിറ്റീവ് സാമ്പിളുകളുടെ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയാണ് LOD.മറ്റൊരു വിധത്തിൽ പറഞ്ഞാൽ, ഒരു കൂട്ടം ടാർഗെറ്റ് ജീൻ പകർപ്പുകളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന LOD യുടെ സാന്ദ്രത പരാജയപ്പെട്ട പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളുടെ 5% കവിയാൻ പാടില്ല.മൾട്ടിപ്ലക്സ് qPCR വിശകലനം നടത്തുമ്പോൾ, പ്രത്യേകിച്ച് പോയിന്റ് മ്യൂട്ടേഷനുകൾ അല്ലെങ്കിൽ പോളിമോർഫിസങ്ങൾ ഒരേസമയം കണ്ടെത്തുന്നതിന്, മൾട്ടിപ്ലക്സ് qPCR ഒരേ ട്യൂബിൽ ഒന്നിലധികം ടാർഗെറ്റ് ശകലങ്ങളുടെ കൃത്യത വിട്ടുവീഴ്ച ചെയ്യപ്പെടുന്നില്ല എന്നതിന് തെളിവ് നൽകേണ്ടതുണ്ട്, മൾട്ടിപ്പിൾ ഡിറ്റക്ഷനും സിംഗിൾ ട്യൂബ് ഡിറ്റക്ഷനും കാര്യക്ഷമതയും LODയും ഒന്നുതന്നെയായിരിക്കണം.പ്രത്യേകിച്ചും ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയുള്ള ടാർഗെറ്റ് ജീനുകളും കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയുള്ള ടാർഗെറ്റ് ജീനുകളും ഒരേസമയം വർദ്ധിപ്പിക്കുമ്പോൾ, ഈ പ്രശ്നം ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്.
പ്രശ്നങ്ങളും പരിഹാരങ്ങളുംപൊതുവായി പറഞ്ഞാൽ, qPCR ഡീബഗ്ഗിംഗിൽ പലപ്പോഴും നേരിടുന്ന പ്രശ്നങ്ങൾ ഇനിപ്പറയുന്ന വശങ്ങളിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിക്കുന്നു:
· നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ
പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷന്റെ ബുദ്ധിമുട്ടുള്ള തിരഞ്ഞെടുപ്പും പ്രൈമർ-ഡൈമറുകളുമായുള്ള പ്രശ്‌നവും
·അനീലിംഗ് താപനില കൃത്യമല്ല
· ദ്വിതീയ ഘടന ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയെ ബാധിക്കുന്നു
നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ
നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻസംഭവിക്കുന്നു , പ്രൈമർ ഡിസൈൻ അനുയോജ്യമല്ലെന്ന് പൊതുവെ പരിഗണിക്കപ്പെടുന്നു, എന്നാൽ പ്രൈമറുകൾ മാറ്റാൻ നിങ്ങൾ തിരക്കിലല്ലെങ്കിൽ, നിങ്ങൾക്ക് ആദ്യം ഇനിപ്പറയുന്ന രീതികൾ പരീക്ഷിക്കാം (തത്ത്വവും ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു):
അനീലിംഗ് താപനില വർദ്ധിപ്പിക്കുക - ദുർബലമായ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകൾ നിലനിർത്താൻ കഴിയാത്തവിധം ഉണ്ടാക്കാൻ ശ്രമിക്കുക;
അനീലിംഗ്, നീട്ടൽ സമയം എന്നിവ ചുരുക്കുക - ദുർബലമായ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകളുടെ സാധ്യത കുറയ്ക്കുക;
· പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷൻ കുറയ്ക്കുക - അനാവശ്യ പ്രൈമറുകളും നോൺ-ടാർഗെറ്റ് മേഖലകളും ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള സാധ്യത കുറയ്ക്കുക;
കുറഞ്ഞ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത
നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ വിപരീത സാഹചര്യം - കുറഞ്ഞ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത, കുറഞ്ഞ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത കൈകാര്യം ചെയ്യുന്നതിനുള്ള നടപടികൾ എന്നിവ നേരെ വിപരീതമാണ്:
· അനീലിംഗ്, ദീർഘിപ്പിക്കൽ സമയം നീട്ടുക;
മൂന്ന്-ഘട്ട PCR-ലേക്ക് മാറ്റുക, അനീലിംഗ് താപനില കുറയ്ക്കുക;
പ്രൈമർ ഏകാഗ്രത വർദ്ധിപ്പിക്കുക;
Ps: 90 കളിൽ ജനിച്ച പല ബിരുദ വിദ്യാർത്ഥികളും പരീക്ഷണങ്ങൾ എങ്ങനെ ഡീബഗ് ചെയ്യാമെന്ന് പഠിക്കാൻ തയ്യാറല്ല, കൂടാതെ കിറ്റിന് പ്രശ്നം പൂർണ്ണമായും പരിഹരിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു (ബിരുദാനന്തരം റിസർച്ച് ആൻഡ് ഡെവലപ്‌മെന്റ് ചെയ്യാൻ നിങ്ങൾക്ക് ഒരു റിയാജന്റ് കമ്പനിയിലേക്ക് പോകണമെങ്കിൽ), വാസ്തവത്തിൽ, റിയാജന്റ് നിർമ്മാതാക്കളും ഇതുപോലെ ചിന്തിക്കുന്നു, ഇത് ഒരു വിഡ്ഢിത്തമാണെന്ന് ഞാൻ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു. ദുർബലമായ എച്ച്-ബോണ്ട് ആഗിരണം ഘടകങ്ങൾ.പ്രശ്‌നം എളുപ്പത്തിൽ പരിഹരിക്കുന്നതിന്, ദുർബലമായ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകളെ ആഗിരണം ചെയ്യുന്ന ഒരു ഘടകം ഉണ്ടോ എന്നറിയാൻ വിഡ്ഢികൾ ഇപ്പോഴും റീജന്റ് കമ്പനിയുടെ ആമുഖം വായിക്കേണ്ടതുണ്ട്.
പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷന്റെ ബുദ്ധിമുട്ടുള്ള തിരഞ്ഞെടുപ്പും പ്രൈമർ-ഡൈമറുകളുമായുള്ള പ്രശ്‌നവും
രീതി 1: പൊതുവായി പറഞ്ഞാൽ, qPCR-നുള്ള കിറ്റ് നിർദ്ദേശങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്ന സിസ്റ്റങ്ങളും പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷനുകളും ശുപാർശ ചെയ്തിട്ടുണ്ട്.
രീതി 2: പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷൻ ഗ്രേഡിയന്റ് സജ്ജീകരിച്ച് ഡീബഗ്ഗിംഗ്.താഴെയുള്ള ചിത്രം ചിത്രീകരിക്കാൻ ഒരു കമ്പനിയിൽ നിന്ന് മോഷ്ടിച്ചതാണ്.മൂന്ന് പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷൻ ഗ്രേഡിയന്റുകളും (100nM, 250nM, 500nM) നാല് ടെംപ്ലേറ്റ് കോൺസൺട്രേഷൻ ഗ്രേഡിയന്റുകളും (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) ഉപയോഗിച്ച് നിർമ്മിച്ച ഫ്ലൂറസെൻസ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് ഫലങ്ങൾ ചുവടെയുള്ള ചിത്രം കാണിക്കുന്നു.പരീക്ഷണ ഫലങ്ങളുടെ Ct മൂല്യം ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ പ്ലോട്ട് ചെയ്തിരിക്കുന്നു:

പ്രൈമർ കോൺസെൻട്രേഷൻ തിരഞ്ഞെടുക്കൽ ഓരോ പ്രൈമർ കോൺസെൻട്രേഷനും ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ ഒരു വരിയിൽ സംയോജിപ്പിക്കുക:

പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷൻ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നത് വ്യക്തമാണ്, 100nM, 250nM എന്നിവയുടെ പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷന്റെ ലീനിയർ ബന്ധം മികച്ചതാണ്, കൂടാതെ 500nM ന്റെ പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷന്റെ ലീനിയർ ബന്ധം താരതമ്യേന മോശമാണ്.100nM, 250nM എന്നിവയിൽ, 250nM-ന്റെ Ct മൂല്യം താരതമ്യേന ചെറുതാണ്, അതിനാൽ ഒപ്റ്റിമൽ പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷൻ 250nM ആണ്.ഉരുകുന്ന വക്രത്തിൽ സാധാരണയായി ഗുരുതരമായ പ്രൈമർ-ഡൈമറുകൾ കാണാം.രൂപകല്പന ചെയ്ത പ്രൈമറുകൾക്ക് പ്രൈമർ-ഡൈമറുകൾ ഒഴിവാക്കാൻ കഴിയുന്നില്ലെങ്കിലോ?
രീതി 3: പ്രൈമറുകളുടെ അളവ് കുറയ്ക്കുക, അനീലിംഗ് താപനില വർദ്ധിപ്പിക്കുക (വിശദീകരിക്കേണ്ടതില്ല).
അനീലിംഗ് താപനിലയുടെ അനുഭവപരമായ മൂല്യം 60 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസാണ്.നിങ്ങൾക്ക് ഉറപ്പില്ലെങ്കിൽ, കൂടുതൽ അനുയോജ്യമായ അനീലിംഗ് താപനില എങ്ങനെ തിരഞ്ഞെടുക്കാം?പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷൻ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന് തുല്യമാണ് ഉത്തരം -ഗ്രേഡിയന്റ് ടെസ്റ്റ്.പ്രശ്നം വ്യക്തമാക്കാൻ ബയോ-റാഡ് കമ്പനിയിൽ നിന്ന് ഒരു ചിത്രം എടുക്കുക.ഒരു നിശ്ചിത ടാർഗെറ്റ് ശകലത്തിന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി, എട്ട് താപനില ഗ്രേഡിയന്റുകൾ സജ്ജമാക്കുക, ഓരോന്നിനും മൂന്ന് ആവർത്തനങ്ങൾ, ലഭിച്ച ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ് ഇപ്രകാരമാണ്:

അനീലിംഗ് താപനില തിരഞ്ഞെടുക്കൽ:
·70°C, 69°C-അടിസ്ഥാനപരമായി, പ്രൈമറുകൾ കൂട്ടിച്ചേർക്കാൻ കഴിയില്ല, അതിനാൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഇല്ല.
· 67.3 ° C - തുടക്കത്തിൽ ചെറിയ അളവിലുള്ള ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉണ്ട്, Ct മൂല്യം താരതമ്യേന വലുതാണ്.
·64.5°C——Ct മൂല്യം കുറയുന്നു.
60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, 55.0°C എന്നിവയിൽ Ct മൂല്യങ്ങൾ അടിസ്ഥാനപരമായി സ്ഥിരതയുള്ളതായിരിക്കും, എന്നാൽ അവസാന ഫ്ലൂറസെൻസ് മൂല്യങ്ങൾ വ്യത്യസ്തമായിരുന്നു.
എങ്ങനെ തിരഞ്ഞെടുക്കാം?തത്വം: ആദ്യത്തെ തത്വം ഉയർന്ന Ct മൂല്യമാണ്.അതേ Ct മൂല്യത്തിന്, ഡൈമറൈസേഷനും നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും ഒഴിവാക്കാൻ ഉയർന്ന അനീലിംഗ് താപനില തിരഞ്ഞെടുക്കുക.55 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഉയർന്ന ഫ്ലൂറസെൻസ് മൂല്യമുണ്ടെങ്കിലും, അതിൽ ഡൈമറുകൾ അല്ലെങ്കിൽ നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉണ്ടാകാം.
എന്നാൽ നിങ്ങൾ നിങ്ങളെപ്പോലെ മിടുക്കനാണെങ്കിൽ, നിങ്ങൾ തീർച്ചയായും ചിന്തിക്കും: യുക്തിപരമായി പറഞ്ഞാൽ, PCR പ്രതികരണം വളരെ നിർദ്ദിഷ്ടമാണെങ്കിൽ, പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷൻ മിനിമം ആവശ്യകതയെ കവിയുന്നിടത്തോളം, ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈകളും ഡിഎൻടിപികളും പോലെ ഉയർന്നതും താഴ്ന്നതുമായ പോയിന്റുകൾക്ക് ഒരു ഫലവും ഉണ്ടാകില്ല.തീർച്ചയായും, അനീലിംഗ് താപനില ശരിയായി ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുന്നിടത്തോളം, Ct മൂല്യത്തിൽ പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷന്റെ പ്രഭാവം സ്വാഭാവികമായും കുറയ്ക്കും.

അനീലിംഗ് താപനില ശരിയായി ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്‌തിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ CT-യിലെ പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷന്റെ പ്രഭാവം കുറയ്ക്കും
ദ്വിതീയ ഘടന ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയെ ബാധിക്കുന്നു
പ്രശ്നം ചിത്രീകരിക്കാൻ നമുക്ക് ബയോ-റാഡിൽ നിന്ന് ചിത്രം എടുക്കാം.ദ്വിതീയ ഘടനയുള്ള ഒരു ജീനിനെ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് ഇത് ഒരു താപനില ഗ്രേഡിയന്റും രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുന്നു.

ദ്വിതീയ ഘടന പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നു
താപനില ഗ്രേഡിയന്റ് കുറയുമ്പോൾ, ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ പ്രത്യക്ഷപ്പെടാൻ തുടങ്ങുകയും Ct മൂല്യം മുന്നോട്ട് നീങ്ങുകയും 60.7 ° C ൽ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ മൂല്യത്തിൽ എത്തുകയും ചെയ്യുന്നു, തുടർന്ന് താപനില ഗ്രേഡിയന്റ് കുറയുമ്പോൾ Ct മൂല്യം വലുതായിത്തീരുന്നു.നേരെമറിച്ച്, താപനില വർദ്ധിക്കുന്നതിനനുസരിച്ച്, ദ്വിതീയ ഘടന തുറക്കുകയും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത വർദ്ധിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.ഒരു നിശ്ചിത താപനിലയിലെത്തിയ ശേഷം, താപനില വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നത് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത മെച്ചപ്പെടുത്താൻ കഴിയില്ല.കാരണം ഈ സമയത്ത് പ്രൈമറുകൾ സ്ഥിരമായി സംയോജിപ്പിക്കാൻ കഴിയില്ല.അതുകൊണ്ടു,ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ Ct മൂല്യമുള്ള താപനില നോക്കുക, ദ്വിതീയ ഘടന ടെംപ്ലേറ്റ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള ഏറ്റവും മികച്ച താപനിലയാണിത്!തീർച്ചയായും, അത് ആവശ്യമില്ലെങ്കിൽ, പ്രൈമറുകൾ മാറ്റുകയും ദ്വിതീയ ഘടന പ്രദേശം ഒഴിവാക്കുകയും ചെയ്യുന്നതാണ് നല്ലത് എന്ന് സ്മാർട്ട് വിഡ്ഢികൾ അറിഞ്ഞിരിക്കണം.
5. ആപ്ലിക്കേഷൻ ലെവൽ
MIQE - ഡാറ്റ വിശകലനം

ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ ഉപകരണമാണ് ഡാറ്റ വിശകലനം പ്രധാനമായും നൽകുന്നത്.മുമ്പത്തെ ലേഖനത്തിൽ, പരീക്ഷണത്തിന്റെ രൂപകൽപ്പനയിൽ വിശദീകരിച്ചിട്ടുള്ള ബ്ലാങ്ക് കൺട്രോൾ പോലുള്ള ധാരാളം ഡാറ്റ വിശകലന പ്രവർത്തനങ്ങൾ നടത്തിയിട്ടുണ്ട്.ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനുകൾ, ആവർത്തന സംഖ്യകൾ മുതലായവ വ്യക്തമാക്കിയിട്ടുണ്ട്., ഇവിടെ നമ്മൾ പ്രധാനമായും വിശദീകരിക്കുന്നത് qPCR ന്റെ പ്രയോഗമാണ്.
qPCR വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ പരീക്ഷണാത്മക പരിശോധനയും ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് രോഗനിർണയവുമാണ് ഏറ്റവും സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന സാഹചര്യങ്ങൾ.
കേവല അളവ്
ലോഗ് (പ്രാരംഭ ഏകാഗ്രത) സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണവുമായി ഒരു രേഖീയ ബന്ധമുണ്ട്.അറിയപ്പെടുന്ന പ്രാരംഭ കോപ്പി നമ്പർ ഉള്ള ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡിൽ നിന്ന് ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് വരയ്ക്കാം, അതായത്, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രതികരണത്തിന്റെ രേഖീയ ബന്ധം ലഭിക്കും.സാമ്പിളിന്റെ Ct മൂല്യം അനുസരിച്ച്, സാമ്പിളിലെ സാന്ദ്രത കണക്കാക്കാം.ഉൾപ്പെടുത്തേണ്ട ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെ അളവ്.

സമ്പൂർണ്ണ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് കണക്കുകൂട്ടൽ രീതി
സമ്പൂർണ്ണ അളവ് നിർണ്ണയിക്കുന്നത് സാധാരണ വക്രത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതായിരിക്കണം.ഒരു സാധാരണ വക്രം ഉണ്ടാക്കാൻ, ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് ആവശ്യമാണ്.സാധാരണയായി, ടാർഗെറ്റ് ജീൻ ക്ലോണിംഗ് വഴി ലഭിക്കുന്ന പ്ലാസ്മിഡാണ് സ്റ്റാൻഡേർഡ്.എന്തുകൊണ്ടാണ് ഇത് പ്ലാസ്മിഡ്?കാരണം വൃത്താകൃതിയിലുള്ള പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎ ഏറ്റവും സ്ഥിരതയുള്ളതാണ്.ഇരട്ടിപ്പിക്കൽ അനുപാതം (10 മടങ്ങ് നേർപ്പിക്കൽ) അനുസരിച്ച് 5 മുതൽ 6 ഗ്രേഡിയന്റുകളിൽ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഉൽപ്പന്നം നേർപ്പിക്കുക, നേർപ്പിക്കുമ്പോൾ ഏകതാനത ശ്രദ്ധിക്കുക.Ct മൂല്യം 15-30 ന് ഇടയിൽ കുറയട്ടെ.

സ്റ്റാൻഡേർഡ് തയ്യാറെടുപ്പ്
അതേ സമയം, പരിശോധിക്കേണ്ട സാമ്പിളും അതിനനുസരിച്ച് നേർപ്പിക്കണം (ഡില്യൂഷൻ ഘടകം ഓർക്കുക), കൂടാതെ Ct മൂല്യവും 15-30 ന് ഇടയിൽ കുറയണം.സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഉൽപ്പന്നം + പരിശോധിക്കേണ്ട സാമ്പിൾ ഒരുമിച്ച് മെഷീനിൽ ഇടുന്നു.ഓട്ടത്തിന് ശേഷം, സ്റ്റാൻഡേർഡ് പദാർത്ഥം ഉപയോഗിച്ച് ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് ഉണ്ടാക്കി, ഏകാഗ്രത കണക്കാക്കാൻ പരിശോധിക്കേണ്ട സാമ്പിളുകൾ സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവിലേക്ക് കൊണ്ടുവന്നു.
ഹെപ്പറ്റൈറ്റിസ് ബി വൈറസ് എച്ച്ബിവി ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ ഒരു സാധാരണ കേവല അളവാണ്, ഇത് 1 മില്ലി രക്തത്തിൽ വൈറസ് കോപ്പി നമ്പർ കണക്കാക്കാം.
കോപ്പി നമ്പറിന്റെ കണക്കുകൂട്ടൽ
പരിശോധിക്കേണ്ട സാമ്പിൾ കോൺസൺട്രേഷൻ (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × നേർപ്പിക്കൽ ഘടകം
സാമ്പിൾ തന്മാത്രാ ഭാരം = ബേസുകളുടെ എണ്ണം × 324
പരിശോധിക്കേണ്ട സാമ്പിളിന്റെ പകർപ്പ് നമ്പർ (പകർപ്പുകൾ/ഉൾ) = പരിശോധിക്കേണ്ട സാമ്പിളിന്റെ സാന്ദ്രത / സാമ്പിളിന്റെ തന്മാത്രാ ഭാരം × 6 × 1014

കോപ്പി നമ്പറിന്റെ കണക്കുകൂട്ടൽ രീതി

അളവ് നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനുള്ള കണക്കുകൂട്ടൽ രീതിയാണ് മുകളിൽ പറഞ്ഞിരിക്കുന്നത്.ജൂനിയർ ഹൈസ്കൂളിൽ നിന്ന് ബിരുദം നേടിയ ശേഷം പരിഹരിക്കാവുന്ന ഒരു ഗണിതശാസ്ത്ര പ്രശ്നമാണിത്, ഗണിതശാസ്ത്ര പ്രശ്നങ്ങൾ സാധാരണയായി കമ്പ്യൂട്ടറുകൾ വഴി പരിഹരിക്കുന്നു.നിങ്ങൾക്ക് മനസ്സിലായില്ലെങ്കിൽ, നിങ്ങൾക്ക് ആശയവിനിമയം നടത്താൻ വരാം.
ആപേക്ഷിക അളവ്
ആപേക്ഷിക അളവ് പ്രധാനമായും ശാസ്ത്രീയ ഗവേഷണങ്ങളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു.1 മില്ലി രക്തത്തിൽ എത്ര വൈറസുകൾ ഉണ്ട്, ഇത് ഒരു ഡിഎൻഎ വൈറസ് ആണ്, ഇത് താരതമ്യേന നിർണായകമായ ഒരു സംഭവമാണ്: രക്തത്തിന്റെ അളവ് നിർണ്ണയിക്കാനാകും, ഡിഎൻഎ വൈറസ് താരതമ്യേന സ്ഥിരതയുള്ളതാണ്.എന്നിരുന്നാലും, ഒരു ഇലയിലെ ഒരു നിശ്ചിത ജീനിന്റെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കോപ്പികളുടെ എണ്ണം താരതമ്യം ചെയ്യുന്നത് ഞങ്ങൾക്ക് ബുദ്ധിമുട്ടാണ്, കാരണം ഇലയുടെ വലുപ്പം, ഭാരം, ആർദ്രത എന്നിവ നിർണ്ണയിക്കാൻ പ്രയാസമാണ്, വേർതിരിച്ചെടുത്ത ആർഎൻഎയുടെ അളവ് നിർണ്ണയിക്കാൻ പ്രയാസമാണ്, കൂടാതെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന്റെ കാര്യക്ഷമതയും നിർണ്ണയിക്കാൻ പ്രയാസമാണ്, അതായത്, പരീക്ഷണാത്മക ഡാറ്റ ഉപയോഗിക്കാൻ കഴിയില്ല.
അതിനാൽ, ആപേക്ഷിക അളവ് ഒരു ഘടകം അവതരിപ്പിക്കണം:ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീൻ.
മറ്റൊരു വിധത്തിൽ പറഞ്ഞാൽ, ആപേക്ഷിക അളവ് എന്നത് യഥാർത്ഥത്തിൽ ടാർഗെറ്റ് ജീനും ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനും തമ്മിലുള്ള താരതമ്യമാണ്.ഒരേ ടിഷ്യുവിലും ഒരേ കോശത്തിലും താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, സാമ്പിൾ വലുപ്പം, ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ തുക, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കാര്യക്ഷമത, പിസിആർ കാര്യക്ഷമത എന്നിവയുടെ സ്വാധീനം താരതമ്യേന ചെറുതാണ്.ചെറിയ സാമ്പിൾ വലുപ്പം കാരണം, ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനുകളും ടാർഗെറ്റ് ജീനുകളും താരതമ്യേന കുറഞ്ഞു.അതുകൊണ്ടാണ് ഞങ്ങൾ മുമ്പ് ഏകത്വത്തിനും സ്ഥിരതയ്ക്കും ഊന്നൽ നൽകിയത്.
ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനുകൾ പൊതുവെയാണ്ഹൗസ് കീപ്പിംഗ് ജീനുകൾ(ഹൗസ് കീപ്പിംഗ് ജീനുകൾ), ഇത് എല്ലാ കോശങ്ങളിലും സ്ഥിരമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ജീനുകളുടെ ഒരു വിഭാഗത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, കൂടാതെ അവയുടെ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ കോശങ്ങളുടെ അടിസ്ഥാന ജീവിത പ്രവർത്തനങ്ങൾ നിലനിർത്താൻ ആവശ്യമാണ്.
ഈ ആശയം ആശയക്കുഴപ്പത്തിലാക്കരുത്.ഹൗസ് കീപ്പിംഗ് ജീനുകൾ ജീവശാസ്ത്രപരമായ പ്രവർത്തന പദങ്ങളാണ്, അതേസമയം ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനുകൾ പരീക്ഷണാത്മക സാങ്കേതിക പദങ്ങളാണ്.ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനുകളായി തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന് മുമ്പ് ഹൗസ് കീപ്പിംഗ് ജീനുകൾക്ക് മൂല്യനിർണ്ണയം ആവശ്യമാണ്.
ഉദാഹരണത്തിന്, വ്യത്യസ്ത ടിഷ്യൂ സെല്ലുകളിൽ അവയുടെ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലുകൾ പരിശോധിക്കുന്നതിനായി ചുവടെയുള്ള ചിത്രത്തിൽ ഞങ്ങൾ നിരവധി ഹൗസ് കീപ്പിംഗ് ജീനുകൾ തിരഞ്ഞെടുത്തു, കൂടാതെ β-2-മൈക്രോഗ്ലോബുലിൻ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലുകൾ മറ്റ് മൂന്ന് ജീനുകളിൽ നിന്ന് തികച്ചും വ്യത്യസ്തമാണെന്ന് കണ്ടെത്തി, അതിനാൽ അവ ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനുകളായി ഉപയോഗിക്കാൻ കഴിയില്ല.

ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനിന്റെ തിരുത്തൽ പ്രവർത്തനം മനസ്സിലാക്കിയ ശേഷം, ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനിന്റെ ആമുഖം കാരണം രണ്ട് അൽഗോരിതങ്ങൾ ഉരുത്തിരിഞ്ഞു.
· ഡബിൾ സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് രീതി
·2 – △△Ct രീതി (CT മൂല്യം താരതമ്യം ചെയ്യുന്ന രീതി)
സ്പീഷിസുകളും ജീൻ പ്രവർത്തനങ്ങളും പഠിക്കാൻ നിങ്ങൾക്ക് താൽപ്പര്യമുണ്ടെങ്കിൽ, അൽഗോരിതങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള ഗവേഷണം ഉപേക്ഷിച്ച് ഫോർമുലകൾ നേരിട്ട് ഉപയോഗിക്കുക, അല്ലെങ്കിൽ മെഷീനുകൾ നേരിട്ട് ഉപയോഗിക്കുക;നിങ്ങൾ ഗണിതത്തിലും എഞ്ചിനീയറിംഗിലും നേരായ വ്യക്തിയാണെങ്കിൽ, ദയവായി മടിക്കേണ്ടതില്ല.
ഇരട്ട സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് രീതി
കൺട്രോൾ സാമ്പിളിന്റെ ടാർഗെറ്റ് ജീനും ഹൗസ്‌കീപ്പിംഗ് ജീനും സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് വഴി പരീക്ഷിക്കേണ്ട സാമ്പിളും അളക്കുക, തുടർന്ന് ആപേക്ഷിക എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലായ കണക്കുകൂട്ടൽ ഫോർമുല അനുസരിച്ച് ആപേക്ഷിക മൂല്യം കണക്കാക്കുക.
പ്രയോജനങ്ങൾ: ലളിതമായ വിശകലനം, താരതമ്യേന ലളിതമായ പരീക്ഷണാത്മക ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ
പോരായ്മ: ഓരോ ജീനിനും, ഓരോ റൗണ്ട് പരീക്ഷണങ്ങളും ഒരു സാധാരണ വക്രം ഉണ്ടാക്കണം
ആപ്ലിക്കേഷൻ: ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ റെഗുലേഷന്റെ പഠനത്തിൽ ഏറ്റവും സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്നതും അംഗീകരിക്കപ്പെട്ടതുമായ രണ്ട് ആപേക്ഷിക അളവ് രീതികളിൽ ഒന്ന്
സൂത്രവാക്യം ഇപ്രകാരമാണ്:

ഉദാഹരണങ്ങൾ ഇപ്രകാരമാണ്:

അളവ് ഫലത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി ആപേക്ഷിക തുക കണക്കാക്കുക
2 - △△Ct രീതി (CT മൂല്യം താരതമ്യം ചെയ്യുന്ന രീതി)

പ്രയോജനങ്ങൾ: ഒരു സാധാരണ വക്രം ഉണ്ടാക്കേണ്ടതില്ല
അസൗകര്യങ്ങൾ: ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത ഏകദേശം 100% ആണെന്ന് അനുമാനിക്കപ്പെടുന്നു;സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ <5% ആണ്, സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ്, ഓരോ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും തമ്മിലുള്ള കാര്യക്ഷമത എന്നിവ സ്ഥിരതയുള്ളതാണെന്ന് അനുമാനിക്കപ്പെടുന്നു;പരീക്ഷണാത്മക സാഹചര്യങ്ങളുടെ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ കൂടുതൽ സങ്കീർണ്ണമാണ്.
ആപ്ലിക്കേഷൻ: ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ റെഗുലേഷന്റെ പഠനത്തിൽ ഏറ്റവും സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്നതും അംഗീകരിക്കപ്പെട്ടതുമായ രണ്ട് ആപേക്ഷിക അളവ് രീതികളിൽ ഒന്ന്

തീർച്ചയായും, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത പൂർണ്ണമായും അസാധ്യമാണ് 1. തിരുത്തൽ രീതി: ടാർഗെറ്റ് ജീനിനും റഫറൻസ് ജീനിനും ഒരേ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയുണ്ടെന്ന് നമുക്കറിയാം, എന്നാൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത 1 ന് തുല്യമല്ല, തുടർന്ന് 2－△△Ct ഇതുപോലെ ശരിയാക്കാം: (1+E )－△ എന്നതിന് ഉദാഹരണം. കണക്കുകൂട്ടൽ ഫോർമുല 1.95△△Ct ആയി ശരിയാക്കാം
ഇതുവരെ, ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആറിനെക്കുറിച്ചുള്ള ഉള്ളടക്കം അവസാനിച്ചു.