സാധാരണ PCR സാങ്കേതികവിദ്യയിൽ നിന്നാണ് RT-qPCR വികസിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നത്.ഇത് പരമ്പരാഗത പിസിആർ പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിലേക്ക് ഫ്ലൂറസെന്റ് കെമിക്കൽസ് (ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈകൾ അല്ലെങ്കിൽ ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബുകൾ) ചേർക്കുന്നു, കൂടാതെ പിസിആർ അനീലിംഗും വിപുലീകരണ പ്രക്രിയയും അവയുടെ വ്യത്യസ്ത ലുമിനസെന്റ് മെക്കാനിസങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് തത്സമയം കണ്ടെത്തുന്നു.പിസിആറിന്റെ ഓരോ സൈക്കിളിലുമുള്ള ഉൽപ്പന്ന മാറ്റത്തിന്റെ അളവ് കണക്കാക്കാൻ മീഡിയത്തിലെ ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നൽ മാറ്റങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു.നിലവിൽ, ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈ രീതിയും പ്രോബ് രീതിയുമാണ് ഏറ്റവും സാധാരണമായ രീതികൾ.

ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈ രീതി:
SYBR ഗ്രീൻ Ⅰ, PicoGreen, BEBO മുതലായ ചില ഫ്ലൂറസന്റ് ഡൈകൾ സ്വയം പ്രകാശം പുറപ്പെടുവിക്കുന്നില്ല, പക്ഷേ dsDNA യുടെ മൈനർ ഗ്രോവിലേക്ക് ബന്ധിപ്പിച്ച ശേഷം ഫ്ലൂറസെൻസ് പുറപ്പെടുവിക്കുന്നു.അതിനാൽ, PCR പ്രതികരണത്തിന്റെ തുടക്കത്തിൽ, യന്ത്രത്തിന് ഫ്ലൂറസന്റ് സിഗ്നൽ കണ്ടുപിടിക്കാൻ കഴിയില്ല.പ്രതികരണം അനീലിംഗ്-എക്സ്റ്റെൻഷൻ (രണ്ട്-ഘട്ട രീതി) അല്ലെങ്കിൽ എക്സ്റ്റൻഷൻ ഘട്ടം (ത്രീ-സ്റ്റെപ്പ് രീതി) ലേക്ക് പോകുമ്പോൾ, ഈ സമയത്ത് ഇരട്ട സ്ട്രോണ്ടുകൾ തുറക്കുന്നു, പുതിയ ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് സ്ട്രാൻഡ് സിന്തസിസ് സമയത്ത്, ഫ്ലൂറസെന്റ് തന്മാത്രകൾ ഡിഎസ്ഡിഎൻഎ മൈനർ ഗ്രോവിൽ സംയോജിപ്പിച്ച് ഫ്ലൂറസെൻസ് പുറപ്പെടുവിക്കുന്നു.പിസിആർ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം കൂടുന്നതിനനുസരിച്ച്, കൂടുതൽ കൂടുതൽ ചായങ്ങൾ ഡിഎസ്ഡിഎൻഎയുമായി സംയോജിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലും തുടർച്ചയായി മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നു.ഉദാഹരണമായി SYBR ഗ്രീൻ Ⅰ എടുക്കുക.
അന്വേഷണ രീതി:
ഏറ്റവും സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ജലവിശ്ലേഷണ പേടകമാണ് തക്മാൻ പേടകം.അന്വേഷണത്തിന്റെ 5′ അറ്റത്ത് ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പ് ഉണ്ട്, സാധാരണയായി FAM.പ്രോബ് തന്നെ ടാർഗെറ്റ് ജീനുമായി പൂരകമായ ഒരു ശ്രേണിയാണ്.ഫ്ലൂറോഫോറിന്റെ 3′ അറ്റത്ത് ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വഞ്ചിംഗ് ഗ്രൂപ്പ് ഉണ്ട്.ഫ്ലൂറസെൻസ് റെസൊണൻസ് എനർജി ട്രാൻസ്ഫർ (Förster resonance energy transfer, FRET) തത്വമനുസരിച്ച്, റിപ്പോർട്ടർ ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പും (ഡോണർ ഫ്ലൂറസെന്റ് മോളിക്യൂൾ) ക്വഞ്ചിംഗ് ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പും (അക്സെപ്റ്റർ ഫ്ലൂറസെന്റ് തന്മാത്ര) ഉത്തേജക സ്പെക്ട്രം ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുമ്പോൾ, ഭ്രമണത്തിന്റെ ദൂരപരിധി വളരെ അടുത്തുവരും സ്വീകാര്യമായ തന്മാത്രയുടെ ഫ്ലൂറസെൻസ്, ഓട്ടോഫ്ലൂറസെൻസ് ദുർബലമാകുമ്പോൾ.അതിനാൽ, പിസിആർ പ്രതികരണത്തിന്റെ തുടക്കത്തിൽ, അന്വേഷണം സ്വതന്ത്രവും സിസ്റ്റത്തിൽ കേടുകൂടാതെയുമിരിക്കുമ്പോൾ, റിപ്പോർട്ടർ ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പ് ഫ്ലൂറസെൻസ് പുറപ്പെടുവിക്കില്ല.അനീലിംഗ് ചെയ്യുമ്പോൾ, പ്രൈമറും പ്രോബും ടെംപ്ലേറ്റുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു.വിപുലീകരണ ഘട്ടത്തിൽ, പോളിമറേസ് തുടർച്ചയായി പുതിയ ശൃംഖലകളെ സമന്വയിപ്പിക്കുന്നു.ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന് 5′-3′ എക്സോന്യൂക്ലീസ് പ്രവർത്തനമുണ്ട്.അന്വേഷണത്തിൽ എത്തുമ്പോൾ, ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് ടെംപ്ലേറ്റിൽ നിന്ന് പ്രോബിനെ ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യും, റിപ്പോർട്ടർ ഫ്ലൂറസന്റ് ഗ്രൂപ്പിനെ ക്വഞ്ചർ ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പിൽ നിന്ന് വേർതിരിക്കുകയും ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നൽ പുറത്തുവിടുകയും ചെയ്യും.പേടകവും ടെംപ്ലേറ്റും തമ്മിൽ പരസ്പരം ബന്ധമുള്ളതിനാൽ, പരിശോധനയുടെ കൃത്യതയുടെയും സംവേദനക്ഷമതയുടെയും അടിസ്ഥാനത്തിൽ ഡൈ രീതിയേക്കാൾ പ്രോബ് രീതി മികച്ചതാണ്.

ചിത്രം 1 qRT-PCR തത്വം

പ്രൈമർ ഡിസൈൻ
തത്വങ്ങൾ:

ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് സീരീസിന്റെ സംരക്ഷിത മേഖലയിൽ പ്രൈമറുകൾ രൂപകല്പന ചെയ്യണം, കൂടാതെ പ്രത്യേകത ഉണ്ടായിരിക്കണം.

cDNA സീക്വൻസ് ഉപയോഗിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്, കൂടാതെ mRNA സീക്വൻസും സ്വീകാര്യമാണ്.ഇല്ലെങ്കിൽ, ഡിഎൻഎ സീക്വൻസിൻറെ സിഡിഎസ് റീജിയൻ ഡിസൈൻ കണ്ടെത്തുക.
ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ ദൈർഘ്യം 80-150bp ആണ്, ഏറ്റവും ദൈർഘ്യമേറിയത് 300bp ആണ്, പ്രൈമർ ദൈർഘ്യം സാധാരണയായി 17-25 ബേസുകൾക്കിടയിലാണ്, കൂടാതെ അപ്സ്ട്രീം, ഡൗൺസ്ട്രീം പ്രൈമറുകൾ തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസം വളരെ വലുതായിരിക്കരുത്.

G+C ഉള്ളടക്കം 40% നും 60% നും ഇടയിലാണ്, 45-55% ആണ് ഏറ്റവും മികച്ചത്.
TM മൂല്യം 58-62 ഡിഗ്രിക്ക് ഇടയിലാണ്.
പ്രൈമർ ഡൈമറുകളും സെൽഫ്-ഡൈമറുകളും ഒഴിവാക്കാൻ ശ്രമിക്കുക, (തുടർച്ചയായ 4 ജോഡി കോംപ്ലിമെന്ററി ബേസുകളിൽ കൂടുതൽ ദൃശ്യമാകരുത്) ഹെയർപിൻ ഘടന, ഒഴിവാക്കാനാകാത്ത പക്ഷം, ΔG<4.5kJ/mol* ആക്കുക, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സമയത്ത് gDNA നീക്കം ചെയ്തിട്ടുണ്ടെന്ന് നിങ്ങൾക്ക് ഉറപ്പാക്കാൻ കഴിയുന്നില്ലെങ്കിൽ, GDN യുടെ പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുന്നതാണ് നല്ലത്. T/C, A/G തുടർച്ചയായ ഘടന (2-3) പ്രൈമറുകളും അല്ലാത്തതും
വ്യതിരിക്തമായ ആംപ്ലിഫൈഡ് സീക്വൻസിൻറെ ഹോമോളജി 70% ൽ താഴെയോ അല്ലെങ്കിൽ 8 കോംപ്ലിമെന്ററി ബേസ് ഹോമോളജിയോ ആണ് നല്ലത്.
ഡാറ്റാബേസ്:
കീവേഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് CottonFGD തിരയുക
പ്രൈമർ ഡിസൈൻ:
IDT-qPCR പ്രൈമർ ഡിസൈൻ

Fig2 IDT ഓൺലൈൻ പ്രൈമർ ഡിസൈൻ ടൂൾ പേജ്

Fig3 ഫല പേജ് ഡിസ്പ്ലേ
lncRNA പ്രൈമറുകളുടെ രൂപകൽപ്പന:
lncRNA:mRNA യുടെ അതേ ഘട്ടങ്ങൾ.
miRNA:സ്റ്റെം-ലൂപ്പ് രീതിയുടെ തത്വം: എല്ലാ miRNA-കളും ഏകദേശം 23 nt ന്റെ ചെറിയ സീക്വൻസുകൾ ആയതിനാൽ, നേരിട്ട് PCR കണ്ടെത്തൽ നടത്താൻ കഴിയില്ല, അതിനാൽ സ്റ്റെം-ലൂപ്പ് സീക്വൻസ് ടൂൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു.സ്റ്റെം-ലൂപ്പ് സീക്വൻസ് എന്നത് ഏകദേശം 50 nt ന്റെ ഒറ്റ-ധാരയുള്ള DNA ആണ്, അതിന് സ്വയം ഒരു ഹെയർപിൻ ഘടന ഉണ്ടാക്കാൻ കഴിയും.3 'അറ്റം miRNA ഭാഗിക ശകലത്തിന് പൂരകമായി രൂപകൽപ്പന ചെയ്യാൻ കഴിയും, തുടർന്ന് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സമയത്ത് ടാർഗെറ്റ് miRNA സ്റ്റെം-ലൂപ്പ് സീക്വൻസുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും, കൂടാതെ qPCR നിർണ്ണയിക്കുന്ന ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ ദൈർഘ്യത്തിന് അനുസൃതമായി മൊത്തം ദൈർഘ്യം 70bp വരെ എത്താം.ടെയിലിംഗ് miRNA പ്രൈമർ ഡിസൈൻ.
ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ-നിർദ്ദിഷ്ട കണ്ടെത്തൽ:
ഓൺലൈൻ സ്ഫോടന ഡാറ്റാബേസ്: ക്രമാനുഗതമായ സാമ്യം അനുസരിച്ച് കോട്ടൺ എഫ്ജിഡി സ്ഫോടനം
ലോക്കൽ ബ്ലാസ്റ്റ്: ലോക്കൽ ബ്ലാസ്റ്റ് ചെയ്യാൻ Blast+ ഉപയോഗിക്കുന്നത് നോക്കൂ, ലിനക്സിനും മാക്കോസിനും നേരിട്ട് ഒരു പ്രാദേശിക ഡാറ്റാബേസ് സ്ഥാപിക്കാൻ കഴിയും, ഉബുണ്ടു ബാഷ് ഇൻസ്റ്റാൾ ചെയ്തതിന് ശേഷവും win10 സിസ്റ്റം ചെയ്യാവുന്നതാണ്.പ്രാദേശിക സ്ഫോടന ഡാറ്റാബേസും പ്രാദേശിക സ്ഫോടനവും സൃഷ്ടിക്കുക;win10-ൽ ഉബുണ്ടു ബാഷ് തുറക്കുക.
ശ്രദ്ധിക്കുക: അപ്‌ലാൻഡ് കോട്ടൺ, സീ ഐലൻഡ് കോട്ടൺ എന്നിവ ടെട്രാപ്ലോയിഡ് വിളകളാണ്, അതിനാൽ സ്ഫോടനത്തിന്റെ ഫലം പലപ്പോഴും രണ്ടോ അതിലധികമോ പൊരുത്തങ്ങളായിരിക്കും.മുൻകാലങ്ങളിൽ, സ്ഫോടനം നടത്താൻ NAU cds ഒരു ഡാറ്റാബേസായി ഉപയോഗിച്ചാൽ കുറച്ച് SNP വ്യത്യാസങ്ങൾ മാത്രമുള്ള രണ്ട് ഹോമോലോഗസ് ജീനുകൾ കണ്ടെത്താൻ സാധ്യതയുണ്ട്.സാധാരണഗതിയിൽ, രണ്ട് ഹോമോലോഗസ് ജീനുകളെ പ്രൈമർ ഡിസൈൻ ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിക്കാനാവില്ല, അതിനാൽ അവയെ ഒരേ പോലെയാണ് കണക്കാക്കുന്നത്.വ്യക്തമായ ഒരു ഇൻഡൽ ഉണ്ടെങ്കിൽ, പ്രൈമർ സാധാരണയായി ഇൻഡലിലാണ് രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിരിക്കുന്നത്, എന്നാൽ ഇത് പ്രൈമറിന്റെ ദ്വിതീയ ഘടനയിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം സ്വതന്ത്ര ഊർജ്ജം ഉയർന്നതായി മാറുന്നു, ഇത് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത കുറയുന്നതിന് കാരണമാകുന്നു, പക്ഷേ ഇത് ഒഴിവാക്കാനാവില്ല.

പ്രൈമർ സെക്കൻഡറി ഘടന കണ്ടെത്തൽ:
ഘട്ടങ്ങൾ:ഓപ്പൺ ഒലിഗോ 7 → ഇൻപുട്ട് ടെംപ്ലേറ്റ് സീക്വൻസ് → ക്ലോസ് സബ്-വിൻഡോ → സേവ് → ടെംപ്ലേറ്റിൽ പ്രൈമർ കണ്ടെത്തുക, പ്രൈമർ ലെങ്ത് സജ്ജീകരിക്കാൻ ctrl+D അമർത്തുക → സെൽഫ്-ഡൈമറൈസേഷൻ ബോഡി, ഹെറ്ററോഡൈമർ, ഹെയർപിൻ, പൊരുത്തക്കേട് തുടങ്ങിയ വിവിധ ദ്വിതീയ ഘടനകളെ വിശകലനം ചെയ്യുക. ചിത്രം 4-ന്റെ അവസാനത്തെ രണ്ട് ഫലങ്ങളാണ് ചിത്രം.ഫ്രണ്ട് പ്രൈമറിന്റെ ഫലം നല്ലതാണ്, വ്യക്തമായ ഡൈമറും ഹെയർപിൻ ഘടനയും ഇല്ല, തുടർച്ചയായ കോംപ്ലിമെന്ററി ബേസുകളില്ല, കൂടാതെ സ്വതന്ത്ര ഊർജ്ജത്തിന്റെ കേവല മൂല്യം 4.5-ൽ താഴെയാണ്, ബാക്ക് പ്രൈമർ തുടർച്ചയായി കാണിക്കുമ്പോൾ 6 ബേസുകൾ പരസ്പര പൂരകമാണ്, കൂടാതെ സ്വതന്ത്ര ഊർജ്ജം 8.8 ആണ്;കൂടാതെ, 3′ അറ്റത്ത് കൂടുതൽ ഗുരുതരമായ ഒരു ഡൈമർ പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നു, തുടർച്ചയായി 4 ബേസുകളുടെ ഒരു ഡൈമർ പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നു.സ്വതന്ത്ര ഊർജ്ജം ഉയർന്നതല്ലെങ്കിലും, 3′ ഡൈമർ Chl, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രത്യേകതയെയും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയെയും ഗുരുതരമായി ബാധിക്കും.കൂടാതെ, ഹെയർപിനുകൾ, ഹെറ്ററോഡൈമറുകൾ, പൊരുത്തക്കേടുകൾ എന്നിവ പരിശോധിക്കേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്.

Fig3 oligo7 കണ്ടെത്തൽ ഫലങ്ങൾ
ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത കണ്ടെത്തൽ:
പിസിആർ പ്രതികരണത്തിന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത പിസിആർ ഫലങ്ങളെ ഗുരുതരമായി ബാധിക്കുന്നു.കൂടാതെ qRT-PCR-ലും, അളവ് ഫലങ്ങൾക്ക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത വളരെ പ്രധാനമാണ്.പ്രതികരണ ബഫറിലെ മറ്റ് പദാർത്ഥങ്ങളും മെഷീനുകളും പ്രോട്ടോക്കോളുകളും നീക്കം ചെയ്യുക.പ്രൈമറുകളുടെ ഗുണനിലവാരവും qRT-PCR ന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയിൽ വലിയ സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നു.ഫലങ്ങളുടെ കൃത്യത ഉറപ്പാക്കാൻ, ആപേക്ഷിക ഫ്ലൂറസെൻസ് ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനും കേവല ഫ്ലൂറസെൻസ് ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനും പ്രൈമറുകളുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത കണ്ടെത്തേണ്ടതുണ്ട്.ഫലപ്രദമായ qRT-PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത 85% നും 115% നും ഇടയിലാണെന്ന് തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്.രണ്ട് രീതികളുണ്ട്:
1. സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് രീതി:
എ.cDNA മിക്സ് ചെയ്യുക
ബി.ഗ്രേഡിയന്റ് നേർപ്പിക്കൽ
c.qPCR
ഡി.ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത കണക്കാക്കുന്നതിനുള്ള ലീനിയർ റിഗ്രഷൻ സമവാക്യം
2. LinRegPCR
LinRegPCR തത്സമയ RT-PCR ഡാറ്റയുടെ വിശകലനത്തിനുള്ള ഒരു പ്രോഗ്രാമാണ്, SYBR ഗ്രീൻ അല്ലെങ്കിൽ സമാനമായ രസതന്ത്രത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR (qPCR) ഡാറ്റ എന്നും വിളിക്കുന്നു.പ്രോഗ്രാം നോൺ-ബേസ്‌ലൈൻ തിരുത്തിയ ഡാറ്റ ഉപയോഗിക്കുന്നു, ഓരോ സാമ്പിളിലും വെവ്വേറെ ഒരു അടിസ്ഥാന തിരുത്തൽ നടത്തുന്നു, ഒരു വിൻഡോ-ഓഫ്-ലീനിയാരിറ്റി നിർണ്ണയിക്കുന്നു, തുടർന്ന് പിസിആർ ഡാറ്റാ സെറ്റിലൂടെ ഒരു നേർരേഖയ്ക്ക് അനുയോജ്യമാക്കുന്നതിന് ലീനിയർ റിഗ്രഷൻ വിശകലനം ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഈ വരിയുടെ ചരിവിൽ നിന്ന് ഓരോ വ്യക്തിഗത സാമ്പിളിന്റെയും പിസിആർ കാര്യക്ഷമത കണക്കാക്കുന്നു.അനിയന്ത്രിതമായ ഫ്ലൂറസെൻസ് യൂണിറ്റുകളിൽ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ഒരു സാമ്പിളിന്റെ ആരംഭ സാന്ദ്രത കണക്കാക്കാൻ ഒരു ആംപ്ലിക്കോണിലെ ശരാശരി PCR കാര്യക്ഷമതയും ഒരു സാമ്പിളിന് Ct മൂല്യവും ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഡാറ്റ ഇൻപുട്ടും ഔട്ട്‌പുട്ടും ഒരു Excel സ്‌പ്രെഡ്‌ഷീറ്റിലൂടെയാണ്.സാമ്പിൾ മാത്രം
മിക്സിംഗ് ആവശ്യമാണ്, ഗ്രേഡിയന്റ് ഇല്ല
നടപടികൾ ആവശ്യമാണ്:(ഒരു ഉദാഹരണമായി ബോലെ CFX96 എടുക്കുക, വ്യക്തമായ ABI ഉള്ള മെഷീൻ അല്ല)
പരീക്ഷണം:ഇതൊരു സാധാരണ qPCR പരീക്ഷണമാണ്.
qPCR ഡാറ്റ ഔട്ട്പുട്ട്:LinRegPCR-ന് രണ്ട് ഔട്ട്‌പുട്ട് ഫയലുകൾ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയും: RDML അല്ലെങ്കിൽ ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഫലം.വാസ്തവത്തിൽ, ഇത് സൈക്കിൾ നമ്പറിന്റെയും ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നലിന്റെയും തത്സമയ കണ്ടെത്തൽ മൂല്യമാണ്, കൂടാതെ ലീനിയർ സെഗ്മെന്റ് കാര്യക്ഷമതയുടെ ഫ്ലൂറസെൻസ് മാറ്റ മൂല്യം വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിലൂടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ലഭിക്കും.
ഡാറ്റ തിരഞ്ഞെടുക്കൽ: സിദ്ധാന്തത്തിൽ, RDML മൂല്യം ഉപയോഗയോഗ്യമായിരിക്കണം.സോഫ്‌റ്റ്‌വെയറിന് RDML തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയാത്തതാണ് എന്റെ കമ്പ്യൂട്ടറിന്റെ പ്രശ്‌നമെന്ന് കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു, അതിനാൽ യഥാർത്ഥ ഡാറ്റയായി എനിക്ക് എക്‌സൽ ഔട്ട്‌പുട്ട് മൂല്യമുണ്ട്.സാമ്പിളുകൾ ചേർക്കുന്നതിലെ പരാജയം പോലെയുള്ള ഡാറ്റയുടെ ഒരു പരുക്കൻ സ്ക്രീനിംഗ് ആദ്യം നടത്താൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു. ഔട്ട്‌പുട്ട് ഡാറ്റയിൽ പോയിന്റുകൾ ഇല്ലാതാക്കാൻ കഴിയും (തീർച്ചയായും, നിങ്ങൾക്ക് അവ ഇല്ലാതാക്കാൻ കഴിയില്ല, LinRegPCR പിന്നീടുള്ള ഘട്ടത്തിൽ ഈ പോയിന്റുകൾ അവഗണിക്കും)

Fig5 qPCR ഡാറ്റ എക്സ്പോർട്ട്

കാൻഡിഡേറ്റ് സാമ്പിളുകളുടെ ചിത്രം 6 തിരഞ്ഞെടുക്കൽ

ഡാറ്റ ഇൻപുട്ട്:യോഗ്യതാ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഫലങ്ങൾ.xls തുറക്കുക, → LinRegPCR തുറക്കുക → ഫയൽ → excel-ൽ നിന്ന് വായിക്കുക → ചിത്രം 7-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ പാരാമീറ്ററുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുക → ശരി → അടിസ്ഥാനരേഖകൾ നിർണ്ണയിക്കുക ക്ലിക്കുചെയ്യുക

linRegPCR ഡാറ്റ ഇൻപുട്ടിന്റെ Fig7 ഘട്ടങ്ങൾ

ഫലമായി:ആവർത്തനമില്ലെങ്കിൽ, ഗ്രൂപ്പിംഗ് ആവശ്യമില്ല.ആവർത്തനമുണ്ടെങ്കിൽ, സാമ്പിൾ ഗ്രൂപ്പിംഗിൽ ഗ്രൂപ്പിംഗ് എഡിറ്റുചെയ്യാനാകും, കൂടാതെ ജീനിന്റെ പേര് ഐഡന്റിഫയറിൽ നൽകുകയും അതേ ജീൻ സ്വയമേവ ഗ്രൂപ്പുചെയ്യുകയും ചെയ്യും.അവസാനമായി, ഫയലിൽ ക്ലിക്ക് ചെയ്യുക, എക്സൽ എക്സ്പോർട്ട് ചെയ്യുക, ഫലങ്ങൾ കാണുക.ഓരോ കിണറിന്റെയും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയും R2 ഫലങ്ങളും പ്രദർശിപ്പിക്കും.രണ്ടാമതായി, നിങ്ങൾ ഗ്രൂപ്പുകളായി വിഭജിക്കുകയാണെങ്കിൽ, ശരിയാക്കിയ ശരാശരി ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത പ്രദർശിപ്പിക്കും.ഓരോ പ്രൈമറിന്റെയും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത 85% നും 115% നും ഇടയിലാണെന്ന് ഉറപ്പാക്കുക.ഇത് വളരെ വലുതോ ചെറുതോ ആണെങ്കിൽ, പ്രൈമറിന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത മോശമാണെന്ന് അർത്ഥമാക്കുന്നു.

ചിത്രം 8 ഫലവും ഡാറ്റ ഔട്ട്പുട്ടും

പരീക്ഷണ പ്രക്രിയ:
RNA ഗുണനിലവാര ആവശ്യകതകൾ:
ശുദ്ധി:1.72.0 സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, ശേഷിക്കുന്ന ഐസോത്തിയോസയനേറ്റ് ഉണ്ടാകാം എന്നാണ്.ശുദ്ധമായ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് A260/A230 ഏകദേശം 2 ആയിരിക്കണം.230 nm-ൽ ശക്തമായ ആഗിരണം ഉണ്ടെങ്കിൽ, ഫിനേറ്റ് അയോണുകൾ പോലുള്ള ജൈവ സംയുക്തങ്ങൾ ഉണ്ടെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.കൂടാതെ, 1.5% അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് വഴി ഇത് കണ്ടെത്താനാകും.മാർക്കർ പോയിന്റ് ചെയ്യുക, കാരണം ssRNA യ്ക്ക് ഡീനാറ്ററേഷൻ ഇല്ല, തന്മാത്രാ ഭാരം ലോഗരിതത്തിന് ഒരു രേഖീയ ബന്ധം ഇല്ല, കൂടാതെ തന്മാത്രാ ഭാരം ശരിയായി പ്രകടിപ്പിക്കാൻ കഴിയില്ല.ഏകാഗ്രത: സൈദ്ധാന്തികമായിഅല്ല100ng/ul-ൽ കുറവ്, സാന്ദ്രത വളരെ കുറവാണെങ്കിൽ, ശുദ്ധി പൊതുവെ ഉയരം കുറവായിരിക്കും

Fig9 RNA ജെൽ

കൂടാതെ, സാമ്പിൾ വിലയേറിയതും ആർ‌എൻ‌എ സാന്ദ്രത ഉയർന്നതുമാണെങ്കിൽ, വേർതിരിച്ചെടുത്തതിന് ശേഷം അത് അലിക്വോട്ട് ചെയ്യാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു, കൂടാതെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനായി 100-300ng/ul എന്ന അന്തിമ സാന്ദ്രതയിലേക്ക് RNA നേർപ്പിക്കുക.ഇൻറിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രക്രിയ, mRNA ട്രാൻസ്‌ക്രൈബ് ചെയ്യുമ്പോൾ, പോളിഎ ടെയിലുകളുമായി പ്രത്യേകമായി ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയുന്ന ഒലിഗോ (dt) പ്രൈമറുകൾ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനായി ഉപയോഗിക്കുന്നു, അതേസമയം lncRNA, circRNA എന്നിവ മൊത്തം RNAയുടെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനായി റാൻഡം ഹെക്സാമർ (റാൻഡം 6 mer) പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു.പല കമ്പനികളും ഇപ്പോൾ പ്രത്യേക ടെയിലിംഗ് കിറ്റുകൾ പുറത്തിറക്കിയിട്ടുണ്ട്.സ്റ്റെം-ലൂപ്പ് രീതിക്ക്, ടെയ്‌ലിംഗ് രീതി കൂടുതൽ സൗകര്യപ്രദവും ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട്, റീജന്റ്-സേവിംഗ് എന്നിവയുമാണ്, എന്നാൽ ഒരേ കുടുംബത്തിലെ മൈആർഎൻഎകളെ വേർതിരിച്ചറിയുന്നതിന്റെ ഫലം സ്റ്റെം-ലൂപ്പ് രീതി പോലെ മികച്ചതായിരിക്കരുത്.ഓരോ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കിറ്റിനും ജീൻ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകളുടെ (സ്റ്റെം-ലൂപ്പുകൾ) സാന്ദ്രതയ്ക്ക് ആവശ്യകതകളുണ്ട്.miRNA യ്ക്ക് ഉപയോഗിക്കുന്ന ആന്തരിക റഫറൻസ് U6 ആണ്.സ്റ്റെം-ലൂപ്പ് ഇൻവേർഷൻ പ്രക്രിയയിൽ, U6 ന്റെ ഒരു ട്യൂബ് വെവ്വേറെ റിവേഴ്‌സ് ചെയ്യണം, കൂടാതെ U6 ന്റെ മുന്നിലും പിന്നിലും പ്രൈമറുകൾ നേരിട്ട് ചേർക്കണം.സർക്ആർഎൻഎയ്ക്കും എൽഎൻസിആർഎൻഎയ്ക്കും ആന്തരിക റഫറൻസായി എച്ച്കെജികൾ ഉപയോഗിക്കാം.ഇൻcDNA കണ്ടെത്തൽ,
ആർഎൻഎയിൽ പ്രശ്‌നമില്ലെങ്കിൽ, സിഡിഎൻഎയും നന്നായിരിക്കണം.എന്നിരുന്നാലും, പരീക്ഷണത്തിന്റെ പൂർണത പിന്തുടരുകയാണെങ്കിൽ, സിഡികളിൽ നിന്ന് gDNA-യെ വേർതിരിച്ചറിയാൻ കഴിയുന്ന ഒരു ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീൻ (റഫറൻസ് ജീൻ, RG) ഉപയോഗിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.പൊതുവേ, RG ഒരു ഹൗസ് കീപ്പിംഗ് ജീനാണ്., HKG) ചിത്രം 10 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നത് പോലെ;ആ സമയത്ത്, ഞാൻ സോയാബീൻ സ്റ്റോറേജ് പ്രോട്ടീൻ ഉണ്ടാക്കുകയായിരുന്നു, കൂടാതെ ആന്തരിക റഫറൻസായി ഇൻട്രോണുകൾ അടങ്ങിയ actin7 ഉപയോഗിച്ചു.gDNA-യിലെ ഈ പ്രൈമറിന്റെ ആംപ്ലിഫൈഡ് ശകലത്തിന്റെ വലിപ്പം 452bp ആയിരുന്നു, cDNA ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിൽ അത് 142bp ആയിരുന്നു.അപ്പോൾ പരിശോധനാ ഫലങ്ങൾ സിഡിഎൻഎയുടെ ഒരു ഭാഗം യഥാർത്ഥത്തിൽ ജിഡിഎൻഎ വഴി മലിനമാക്കിയതായി കണ്ടെത്തി, കൂടാതെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന്റെ ഫലത്തിൽ ഒരു പ്രശ്നവുമില്ലെന്നും ഇത് പിസിആറിന്റെ ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കാമെന്നും തെളിയിച്ചു.അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് നേരിട്ട് സിഡിഎൻഎ ഉപയോഗിച്ച് പ്രവർത്തിപ്പിക്കുന്നത് ഉപയോഗശൂന്യമാണ്, ഇത് ഒരു ഡിഫ്യൂസ് ബാൻഡാണ്, അത് ബോധ്യപ്പെടുത്തുന്നില്ല.

ചിത്രം 10 cDNA കണ്ടെത്തൽ

qPCR വ്യവസ്ഥകളുടെ നിർണ്ണയംകിറ്റിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച് പൊതുവെ പ്രശ്നമില്ല, പ്രധാനമായും tm മൂല്യത്തിന്റെ ഘട്ടത്തിൽ.പ്രൈമർ ഡിസൈൻ സമയത്ത് ചില പ്രൈമറുകൾ നന്നായി രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിട്ടില്ലെങ്കിൽ, tm മൂല്യവും സൈദ്ധാന്തികമായ 60 ° C ഉം തമ്മിൽ വലിയ വ്യത്യാസം ഉണ്ടാകുന്നുവെങ്കിൽ, cDNA സാമ്പിളുകൾ മിക്സഡ് ചെയ്ത ശേഷം, പ്രൈമറുകൾക്കൊപ്പം ഗ്രേഡിയന്റ് PCR പ്രവർത്തിപ്പിക്കാനും ബാൻഡുകളില്ലാതെ താപനില TM മൂല്യമായി സജ്ജീകരിക്കുന്നത് ഒഴിവാക്കാനും ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

ഡാറ്റ വിശകലനം

പരമ്പരാഗത ആപേക്ഷിക ഫ്ലൂറസെൻസ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ പ്രോസസ്സിംഗ് രീതി അടിസ്ഥാനപരമായി 2 അനുസരിച്ചാണ്.-ΔΔCT.ഡാറ്റ പ്രോസസ്സിംഗ് ടെംപ്ലേറ്റ്.

ബന്ധപ്പെട്ട ഉല്പന്നങ്ങൾ:

റിയൽ ടൈം പിസിആർ ഈസി^TM -തഖ്മാൻ

റിയൽ ടൈം പിസിആർ ഈസി^TM –SYBR ഗ്രീൻ ഐ

RT ഈസി I (ആദ്യ സ്‌ട്രാൻഡ് സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസിനുള്ള മാസ്റ്റർ പ്രീമിക്‌സ്)

RT Easy II (qPCR-നുള്ള ആദ്യ സ്ട്രാൻഡ് cDNA സിന്തസിസിനുള്ള മാസ്റ്റർ പ്രീമിക്സ്)