ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സിഗ്നലുകളൊന്നുമില്ല

1.കിറ്റിലെ Taq DNA പോളിമറേസ് കിറ്റിന്റെ അനുചിതമായ സംഭരണം അല്ലെങ്കിൽ കാലഹരണപ്പെടൽ കാരണം അതിന്റെ പ്രവർത്തനം നഷ്ടപ്പെടുന്നു.
ശുപാർശ: കിറ്റിന്റെ സംഭരണ ​​വ്യവസ്ഥകൾ സ്ഥിരീകരിക്കുക;PCR സിസ്റ്റത്തിലേക്ക് Taq DNA പോളിമറേസിന്റെ ഉചിതമായ തുക വീണ്ടും ചേർക്കുക അല്ലെങ്കിൽ അനുബന്ധ പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി ഒരു പുതിയ റിയൽ ടൈം PCR കിറ്റ് വാങ്ങുക.

2.DNA ടെംപ്ലേറ്റിൽ Taq DNA പോളിമറേസിന്റെ ധാരാളം ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ഉണ്ട്.
നിർദ്ദേശം: ടെംപ്ലേറ്റ് പുനഃസ്ഥാപിക്കുക അല്ലെങ്കിൽ ഉപയോഗിച്ച ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ അളവ് കുറയ്ക്കുക.

3.Mg2+ സാന്ദ്രത അനുയോജ്യമല്ല.
ശുപാർശ: ഞങ്ങൾ നൽകുന്ന 2× റിയൽ PCR മിക്‌സിന്റെ Mg2+ സാന്ദ്രത 3.5mM ആണ്.എന്നിരുന്നാലും, ചില പ്രത്യേക പ്രൈമറുകൾക്കും ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്കും, Mg2+ സാന്ദ്രത കൂടുതലായിരിക്കാം.അതിനാൽ, Mg2+ കോൺസൺട്രേഷൻ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുന്നതിന് നിങ്ങൾക്ക് നേരിട്ട് MgCl2 ചേർക്കാവുന്നതാണ്.ഒപ്റ്റിമൈസേഷനായി ഓരോ തവണയും Mg2+ 0.5mM വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

4.പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വ്യവസ്ഥകൾ അനുയോജ്യമല്ല, പ്രൈമർ സീക്വൻസ് അല്ലെങ്കിൽ കോൺസൺട്രേഷൻ അനുചിതമാണ്.
നിർദ്ദേശം: പ്രൈമർ സീക്വൻസിന്റെ കൃത്യത സ്ഥിരീകരിക്കുക, പ്രൈമർ തരംതാഴ്ത്തിയിട്ടില്ല;ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സിഗ്നൽ നല്ലതല്ലെങ്കിൽ, അനീലിംഗ് താപനില കുറയ്ക്കാനും പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷൻ ഉചിതമായി ക്രമീകരിക്കാനും ശ്രമിക്കുക.

5. ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ അളവ് വളരെ കുറവാണ് അല്ലെങ്കിൽ വളരെ കൂടുതലാണ്.
ശുപാർശ: ടെംപ്ലേറ്റ് ലീനിയറൈസേഷൻ ഗ്രേഡിയന്റ് ഡൈല്യൂഷൻ നടത്തുക, തത്സമയ PCR പരീക്ഷണത്തിനായി മികച്ച PCR ഇഫക്റ്റുള്ള ടെംപ്ലേറ്റ് കോൺസൺട്രേഷൻ തിരഞ്ഞെടുക്കുക.

എൻടിസിക്ക് വളരെ ഉയർന്ന ഫ്ലൂറസെൻസ് മൂല്യമുണ്ട്

1.ഓപ്പറേഷൻ സമയത്ത് ഉണ്ടാകുന്ന റീജന്റ് മലിനീകരണം.
ശുപാർശ: റിയൽ ടൈം PCR പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി പുതിയ റിയാഗന്റുകൾ ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുക.

2.പിസിആർ പ്രതികരണ സംവിധാനം തയ്യാറാക്കുന്നതിനിടയിൽ മലിനീകരണം സംഭവിച്ചു.
ശുപാർശ: പ്രവർത്തന സമയത്ത് ആവശ്യമായ സംരക്ഷണ നടപടികൾ കൈക്കൊള്ളുക, ഉദാഹരണത്തിന്: ലാറ്റക്സ് കയ്യുറകൾ ധരിക്കുക, ഫിൽട്ടറുള്ള പൈപ്പറ്റ് ടിപ്പ് ഉപയോഗിക്കുക തുടങ്ങിയവ.

3.പ്രൈമറുകൾ ഡീഗ്രേഡായി, പ്രൈമറുകളുടെ ഡീഗ്രേഡേഷൻ നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷന് കാരണമാകും.
നിർദ്ദേശം: പ്രൈമറുകൾ ഡീഗ്രേഡാണോ എന്ന് കണ്ടെത്താൻ SDS-PAGE ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസ് ഉപയോഗിക്കുക, കൂടാതെ തത്സമയ PCR പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി അവയെ പുതിയ പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുക.

പ്രൈമർ ഡൈമർ അല്ലെങ്കിൽ നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ

1.Mg2+ ഏകാഗ്രത അനുയോജ്യമല്ല.
ശുപാർശ: ഞങ്ങൾ നൽകുന്ന 2× റിയൽ PCR EasyTM മിക്‌സിന്റെ Mg2+ സാന്ദ്രത 3.5 mM ആണ്.എന്നിരുന്നാലും, ചില പ്രത്യേക പ്രൈമറുകൾക്കും ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്കും, Mg2+ സാന്ദ്രത കൂടുതലായിരിക്കാം.അതിനാൽ, Mg2+ കോൺസൺട്രേഷൻ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുന്നതിന് നിങ്ങൾക്ക് നേരിട്ട് MgCl2 ചേർക്കാവുന്നതാണ്.ഒപ്റ്റിമൈസേഷനായി ഓരോ തവണയും Mg2+ 0.5mM വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

2.പിസിആർ അനീലിംഗ് താപനില വളരെ കുറവാണ്.
നിർദ്ദേശം: ഓരോ തവണയും പിസിആർ അനീലിംഗ് താപനില 1℃ അല്ലെങ്കിൽ 2 ഡിഗ്രി വർദ്ധിപ്പിക്കുക.

3.പിസിആർ ഉൽപ്പന്നം ദൈർഘ്യമേറിയതാണ്.
ശുപാർശ: റിയൽ ടൈം PCR ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ ദൈർഘ്യം 100-150bp ആയിരിക്കണം, 500bp-ൽ കൂടരുത്.

4.പ്രൈമറുകൾ തരംതാഴ്ന്നതാണ്, കൂടാതെ പ്രൈമറുകളുടെ അപചയം പ്രത്യേക ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ രൂപത്തിലേക്ക് നയിക്കും.
നിർദ്ദേശം: പ്രൈമറുകൾ ഡീഗ്രേഡാണോ എന്ന് കണ്ടെത്താൻ SDS-PAGE ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസ് ഉപയോഗിക്കുക, കൂടാതെ തത്സമയ PCR പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി അവയെ പുതിയ പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുക.

5.പിസിആർ സിസ്റ്റം അനുചിതമാണ്, അല്ലെങ്കിൽ സിസ്റ്റം വളരെ ചെറുതാണ്.
നിർദ്ദേശം: PCR പ്രതികരണ സംവിധാനം വളരെ ചെറുതാണ്, അത് കണ്ടെത്തൽ കൃത്യത കുറയുന്നതിന് കാരണമാകും.റിയൽ ടൈം പിസിആർ പരീക്ഷണം വീണ്ടും റൺ ചെയ്യാൻ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ ഇൻസ്ട്രുമെന്റ് ശുപാർശ ചെയ്യുന്ന പ്രതികരണ സംവിധാനം ഉപയോഗിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.

ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് മൂല്യങ്ങളുടെ മോശം ആവർത്തനക്ഷമത

1. ഉപകരണം തെറ്റായി പ്രവർത്തിക്കുന്നു.
നിർദ്ദേശം: ഉപകരണത്തിന്റെ ഓരോ PCR ദ്വാരത്തിനും ഇടയിൽ പിശകുകൾ ഉണ്ടാകാം, താപനില മാനേജ്മെൻറ് അല്ലെങ്കിൽ കണ്ടെത്തൽ സമയത്ത് മോശമായ പുനരുൽപാദനക്ഷമതയുടെ ഫലമായി.അനുബന്ധ ഉപകരണത്തിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച് പരിശോധിക്കുക.

2.സാമ്പിൾ പരിശുദ്ധി നല്ലതല്ല.
ശുപാർശ: അശുദ്ധമായ സാമ്പിളുകൾ പരീക്ഷണത്തിന്റെ മോശം പുനരുൽപാദനക്ഷമതയിലേക്ക് നയിക്കും, അതിൽ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെയും പ്രൈമറുകളുടെയും പരിശുദ്ധി ഉൾപ്പെടുന്നു.ടെംപ്ലേറ്റ് പുനഃസ്ഥാപിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്, കൂടാതെ പ്രൈമറുകൾ SDS-PAGE വഴി ശുദ്ധീകരിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.

3.പിസിആർ സിസ്റ്റം തയ്യാറാക്കലും സംഭരണ ​​സമയവും വളരെ നീണ്ടതാണ്.
നിർദ്ദേശം: തയ്യാറാക്കിയതിന് ശേഷം ഉടൻ തന്നെ PCR പരീക്ഷണത്തിനായി റിയൽ ടൈം PCR സിസ്റ്റം ഉപയോഗിക്കുക, അത് അധികനേരം മാറ്റിവെക്കരുത്.

4.പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വ്യവസ്ഥകൾ അനുയോജ്യമല്ല, പ്രൈമർ സീക്വൻസ് അല്ലെങ്കിൽ കോൺസൺട്രേഷൻ അനുചിതമാണ്.
നിർദ്ദേശം: പ്രൈമർ സീക്വൻസിന്റെ കൃത്യത സ്ഥിരീകരിക്കുക, പ്രൈമർ തരംതാഴ്ത്തിയിട്ടില്ല;ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സിഗ്നൽ നല്ലതല്ലെങ്കിൽ, അനീലിംഗ് താപനില കുറയ്ക്കാനും പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷൻ ഉചിതമായി ക്രമീകരിക്കാനും ശ്രമിക്കുക.

5.പിസിആർ സിസ്റ്റം അനുചിതമാണ്, അല്ലെങ്കിൽ സിസ്റ്റം വളരെ ചെറുതാണ്.
നിർദ്ദേശം: PCR പ്രതികരണ സംവിധാനം വളരെ ചെറുതാണ്, അത് കണ്ടെത്തൽ കൃത്യത കുറയുന്നതിന് കാരണമാകും.റിയൽ ടൈം പിസിആർ പരീക്ഷണം വീണ്ടും റൺ ചെയ്യാൻ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ ഇൻസ്ട്രുമെന്റ് ശുപാർശ ചെയ്യുന്ന പ്രതികരണ സംവിധാനം ഉപയോഗിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.