കണ്ടെത്തലിന്റെ പ്രത്യേകത

മിക്ക കേസുകളിലും, പ്രൈമർ ഡിസൈനിന്റെ ഉദ്ദേശ്യം പിസിആറിന്റെ പ്രത്യേകത വർദ്ധിപ്പിക്കുക എന്നതാണ്.പല വേരിയബിളുകളുടെ കൂടുതലോ കുറവോ പ്രവചിക്കാവുന്ന സ്വാധീനത്താൽ ഇത് നിർണ്ണയിക്കപ്പെടുന്നു.ഒരു പ്രധാന വേരിയബിൾ പ്രൈമറിന്റെ 3′അറ്റത്തുള്ള ക്രമമാണ്.

പ്രധാനമായി, സ്പെസിഫിറ്റിക്കായി രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത പിസിആർ അസെകൾ വിശാലമായ ഡൈനാമിക് ശ്രേണിയിൽ ഉയർന്ന ദക്ഷത നിലനിർത്താൻ കൂടുതൽ സാധ്യതയുണ്ട്, കാരണം പരിശോധന നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ നിർമ്മിക്കുന്നില്ല, അതുവഴി പിസിആർ റിയാക്ടറുകളുമായി മത്സരിക്കുകയോ പ്രധാന ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രതികരണത്തെ തടയുകയോ ചെയ്യുന്നു.

തീർച്ചയായും, ചില സന്ദർഭങ്ങളിൽ, പ്രത്യേകതകൾ ഏറ്റവും പ്രധാനമല്ല, ഉദാഹരണത്തിന്, ലക്ഷ്യം അടുത്ത ബന്ധമുള്ളതും എന്നാൽ വ്യത്യസ്ത രോഗകാരികളെ അളക്കുന്നതും, പ്രത്യേക ഡിസൈൻ, ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ, സ്ഥിരീകരണ മാനദണ്ഡങ്ങൾ എന്നിവ ആവശ്യമാണ്.

മെൽറ്റിംഗ് കർവ് എന്നത് ആംപ്ലിക്കോണുകളുടെ പ്രത്യേകത വിലയിരുത്തുന്നതിനുള്ള ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് രീതിയാണ്, കുറഞ്ഞത് ഒരൊറ്റ ടാർഗെറ്റ് വർദ്ധിപ്പിക്കണമോ എന്ന കാര്യത്തിൽ.എന്നിരുന്നാലും, ഉരുകൽ വളവുകൾ തെറ്റിദ്ധരിപ്പിക്കുന്നതാണെന്ന് ഊന്നിപ്പറയേണ്ടതാണ്, കാരണം, ഉദാഹരണത്തിന്, ഉപോത്പന്ന പ്രൈമറുകളുടെയും കുറഞ്ഞ ടെംപ്ലേറ്റ് സാന്ദ്രതയുടെയും സംയോജിത ഫലങ്ങളാൽ അവ ബാധിക്കപ്പെടാം.

P5 |രണ്ട് ടാർഗെറ്റ് ഡിഎൻഎകളുടെ വ്യത്യസ്ത അളവിലുള്ള രണ്ട് കണ്ടെത്തലുകളിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച Tm ഷിഫ്റ്റുകൾ ഉരുകുന്ന വക്രം കാണിക്കുന്നു.

എ. ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിൽ (പരസ്യം), qPCR അളവ് പൂർത്തിയാക്കിയ ശേഷം വ്യക്തമായ പ്രൈമർ ഡൈമർ ഇല്ല.ടെംപ്ലേറ്റ് കോൺസൺട്രേഷൻ 50 കോപ്പികളായി കുറയുന്നതിനാൽ (ഇ), ഒരു നോൺ-സ്പെസിഫിക് ഉൽപ്പന്നം പ്രത്യക്ഷപ്പെടാൻ തുടങ്ങുകയും ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയിൽ (എഫ്) ഒരേയൊരു ഉൽപ്പന്നമായി മാറുകയും ചെയ്യുന്നു.

ബി. ടെസ്റ്റ് എല്ലാ ടാർഗെറ്റ് കോൺസൺട്രേഷനുകളിലും ഒരേ Tms രേഖപ്പെടുത്തി, ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയിൽ പോലും വ്യക്തമായ പ്രൈമർ ഡൈമർ ഇല്ലായിരുന്നു (5 കോപ്പികൾ).ഈ രണ്ട് കണ്ടെത്തൽ രീതികൾ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, NTC-കളിൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങളൊന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല.

വ്യത്യസ്ത സാന്ദ്രതകളിൽ ടെംപ്ലേറ്റ് ഉള്ള സാമ്പിളുകൾക്കൊപ്പം ലഭിച്ച പിരിച്ചുവിടൽ വളവുകൾ P5 കാണിക്കുന്നു.P 5a കാണിക്കുന്നത് ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ രണ്ട് സാന്ദ്രതകളിൽ, ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്ന നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ Tms നിർദ്ദിഷ്ട ആംപ്ലിക്കോണുകളേക്കാൾ കുറവാണെന്നാണ്.

വ്യക്തമായും, കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയിൽ നിലനിൽക്കുന്ന ലക്ഷ്യങ്ങൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഈ കണ്ടെത്തൽ രീതി വിശ്വസനീയമായി ഉപയോഗിക്കാനാവില്ല.

കൗതുകകരമെന്നു പറയട്ടെ, NTC-കൾ, അതായത്, DNA ഇല്ലാത്ത സാമ്പിളുകൾ, (നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത) ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ റെക്കോർഡ് ചെയ്തില്ല, ഇത് പശ്ചാത്തല ജീനോമിക് ഡിഎൻഎയ്ക്ക് നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ/പോളിമറൈസേഷനിൽ പങ്കെടുക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

ചിലപ്പോൾ അത്തരം ബാക്ക്ഗ്രൗണ്ട് പ്രൈമറുകളും നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും പരിഹരിക്കാൻ കഴിയില്ല, എന്നാൽ ഏതെങ്കിലും ടെംപ്ലേറ്റ് കോൺസൺട്രേഷനിലും NTC (P 5b) യിലും നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഇല്ലാത്ത ഒരു കണ്ടെത്തൽ രീതി രൂപകൽപ്പന ചെയ്യാൻ പലപ്പോഴും സാധ്യമാണ്.

ഇവിടെ, 35 Cq ഉപയോഗിച്ച് ടാർഗെറ്റ് കോൺസൺട്രേഷന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ രേഖപ്പെടുത്തുന്നത് പോലും ഒരു പ്രത്യേക പിരിച്ചുവിടൽ വക്രം ഉണ്ടാക്കും.അതുപോലെ, NTC-കൾ നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ ലക്ഷണങ്ങളൊന്നും കാണിച്ചില്ല.ചിലപ്പോൾ, കണ്ടെത്തൽ സ്വഭാവം മാതൃ മദ്യത്തെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കും, കൂടാതെ ചില ബഫർ കോമ്പോസിഷനുകളിൽ നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ മാത്രമേ കണ്ടെത്തിയിട്ടുള്ളൂ, അത് വ്യത്യസ്ത Mg2+ സാന്ദ്രതകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാം.

കണ്ടെത്തലിന്റെ സ്ഥിരത

Ta യുടെ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ qPCR കണ്ടെത്തലിന്റെ അനുഭവപരമായ പരിശോധനയിലും ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ പ്രക്രിയയിലും ഉപയോഗപ്രദമായ ഒരു ഘട്ടമാണ്.NTC വർദ്ധിപ്പിക്കാതെ തന്നെ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ Cq ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്ന താപനില (അല്ലെങ്കിൽ താപനില പരിധി) കാണിക്കുന്നതിലൂടെ ഇത് പ്രൈമർ സെറ്റിന്റെ ദൃഢതയുടെ നേരിട്ടുള്ള സൂചന നൽകുന്നു.

ഉയർന്ന എംആർഎൻഎ എക്സ്പ്രഷൻ ഉള്ള ആളുകൾക്ക് സെൻസിറ്റിവിറ്റിയിലെ രണ്ടോ നാലോ മടങ്ങ് വ്യത്യാസം പ്രധാനമായിരിക്കില്ല, എന്നാൽ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് പരിശോധനകൾക്ക് ഇത് പോസിറ്റീവ്, തെറ്റായ നെഗറ്റീവ് ഫലങ്ങൾ തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസം അർത്ഥമാക്കാം.

qPCR പ്രൈമറുകളുടെ Ta ഗുണങ്ങൾ വളരെയധികം വ്യത്യാസപ്പെടാം.ചില പരിശോധനകൾ വളരെ ശക്തമല്ല, അവ പ്രൈമറുകളുടെ ഒപ്റ്റിമൽ Ta മൂല്യത്തിന് കീഴിൽ നടത്തിയില്ലെങ്കിൽ, അവ പെട്ടെന്ന് തകരും.

ഇത് പ്രധാനമാണ്, കാരണം ഇത്തരത്തിലുള്ള കണ്ടെത്തൽ യഥാർത്ഥ ലോകത്ത് പലപ്പോഴും പ്രശ്‌നകരമാണ്, കൂടാതെ സാമ്പിളിന്റെ പരിശുദ്ധി, ഡിഎൻഎയുടെ സാന്ദ്രത, അല്ലെങ്കിൽ മറ്റ് ഡിഎൻഎയുടെ സാന്നിധ്യം എന്നിവ ഒപ്റ്റിമൽ ആയിരിക്കണമെന്നില്ല.

കൂടാതെ, ടാർഗെറ്റ് കോപ്പി നമ്പർ വിശാലമായ ശ്രേണിയിൽ വ്യത്യാസപ്പെടാം, കൂടാതെ റിയാഗന്റുകൾ, പ്ലാസ്റ്റിക് പാത്രങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ ഉപകരണങ്ങൾ ടെസ്റ്റ് സജ്ജീകരിക്കുമ്പോൾ ഉപയോഗിക്കുന്നതിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായിരിക്കും.

P6|താപ ഗ്രേഡിയന്റ് പിസിആർ കണ്ടെത്തലിന്റെ വ്യത്യസ്തമായ കരുത്ത് കാണിക്കുന്നു.

എ. മനുഷ്യ മസ്തിഷ്ക ആർഎൻഎയിൽ നിന്ന് തയ്യാറാക്കിയ സിഡിഎൻഎയിൽ PCR നടത്താൻ ബയോലൈനിന്റെ സെൻസിഫാസ്റ്റ് SYBR മാസ്റ്റർമിക്സ് (കാറ്റലോഗ് നമ്പർ BIO-98050) ഉപയോഗിക്കുക.

B. അപലീന്റെ (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG) ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ മാപ്പും ഡിസൊല്യൂഷൻ വക്രവും രേഖപ്പെടുത്താൻ ബയോ-റാഡിന്റെ CFX qPCR ഉപകരണം ഉപയോഗിക്കുക.

C. ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG) ന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഗ്രാഫും മെൽറ്റിംഗ് വക്രവും.

D. GFAP-ന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഗ്രാഫും ഡിസൊല്യൂഷൻ വക്രവും (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACTCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs വ്യത്യസ്ത അനീലിംഗ് താപനിലകളിൽ രേഖപ്പെടുത്തുന്നു, 7C താപനില ഗ്രേഡിയന്റിന് കീഴിൽ രേഖപ്പെടുത്തിയ Cq-ലെ വ്യത്യാസം കാണിക്കുന്നു.

P 6 ഒരു അനഭിലഷണീയമായ പരിശോധനയുടെ ഒരു സാധാരണ ഫലം കാണിക്കുന്നു, അവിടെ qPCR 59C നും 67C (P 6a) നും ഇടയിലുള്ള ഗ്രേഡിയന്റ് ടാസ് ഉപയോഗിച്ചാണ് നടത്തിയത്, മൂന്ന് മനുഷ്യ മസ്തിഷ്ക-നിർദ്ദിഷ്ട ജീനുകൾക്കുള്ള പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ച്.

ഓപാലിൻ പ്രൈമറുകൾ അനുയോജ്യമല്ലെന്ന് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഗ്രാഫിൽ നിന്ന് കാണാൻ കഴിയും, കാരണം അവയുടെ ഒപ്റ്റിമൽ Ta ശ്രേണി വളരെ ഇടുങ്ങിയതാണ് (ചിത്രം 6b), അതായത്, Cqs വ്യാപകമായി ചിതറിക്കിടക്കുന്നു, അതിന്റെ ഫലമായി Cqs അവയുടെ ഒപ്റ്റിമൽ Cqs ലോയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുന്നു.

ഈ കണ്ടെത്തൽ രീതി അസ്ഥിരമാണ്, ഇത് ഉപോൽപ്പന്നമായ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം.അതിനാൽ, ഈ ജോടി പ്രൈമറുകൾ പുനർരൂപകൽപ്പന ചെയ്യണം.കൂടാതെ, മെൽറ്റിംഗ് കർവ് അനാലിസിസ് (ഇൻസെറ്റ്) കാണിക്കുന്നത് ഈ കണ്ടെത്തൽ രീതിയുടെ പ്രത്യേകതയും പ്രശ്‌നമുണ്ടാക്കിയേക്കാം, കാരണം ഓരോ Taയുടെയും ദ്രവണാങ്കം വ്യത്യസ്തമാണ്.

P 6c-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ACSBG1 കണ്ടെത്തൽ രീതി മുകളിലുള്ള Opalin കണ്ടെത്തൽ രീതിയേക്കാൾ കൂടുതൽ ശക്തമാണ്, എന്നാൽ ഇത് ഇപ്പോഴും അനുയോജ്യമല്ല, മാത്രമല്ല ഇത് മെച്ചപ്പെടുത്താൻ സാധ്യതയുണ്ട്.

എന്നിരുന്നാലും, ദൃഢതയും പ്രത്യേകതയും തമ്മിൽ ആവശ്യമായ ബന്ധമൊന്നുമില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ ഊന്നിപ്പറയുന്നു, കാരണം ഈ കണ്ടെത്തൽ രീതി നിർമ്മിച്ച പിരിച്ചുവിടൽ വക്രം എല്ലാ ടാസുകളിലും (ഇൻസെറ്റ്) ഒരേ പീക്ക് മൂല്യം കാണിക്കുന്നു.

മറുവശത്ത്, റോബസ്റ്റ്‌നെസ് ടെസ്റ്റ് കൂടുതൽ സഹിഷ്ണുതയുള്ളതാണ്, P 6d-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന GFAP ടെസ്റ്റിലെന്നപോലെ, ടാസിന്റെ വിശാലമായ ശ്രേണിയിൽ സമാനമായ Cqs ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു.

അതേ 8 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ് ശ്രേണിയിൽ ലഭിച്ച Cqs-ലെ വ്യത്യാസം 1-ൽ താഴെയാണ്, ഡിസൊല്യൂഷൻ കർവ് (ഇൻസെറ്റ്) ഈ താപനില പരിധിയിലെ കണ്ടെത്തൽ സ്വഭാവങ്ങളെ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു.കണക്കാക്കിയ ടാസും യഥാർത്ഥ Ta ശ്രേണിയും വളരെ വ്യത്യസ്തമായിരിക്കാമെന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്.

കാര്യക്ഷമമായ പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യാൻ ഗവേഷകരെ സഹായിക്കുന്നതിന് രൂപകൽപ്പന ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന നിരവധി മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങളുണ്ട്, അവയിൽ മിക്കതും ദീർഘകാലമായി സ്ഥാപിതമായ നിയമങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്, കൂടാതെ പ്രൈമറുകളുടെ 3′അന്ത്യത്തിൽ വളരെയധികം ശ്രദ്ധ ചെലുത്തിയിട്ടുണ്ട്.3' അറ്റത്ത് ഒരു G അല്ലെങ്കിൽ C, രണ്ട് G അല്ലെങ്കിൽ C ബേസുകൾ (GC clamp) എന്നിവ ഉൾപ്പെടുത്താൻ പലപ്പോഴും ശുപാർശ ചെയ്യപ്പെടുന്നു, എന്നാൽ അവസാനത്തെ 5 ബേസുകളിൽ രണ്ടിൽ കൂടരുത്.

പ്രായോഗികമായി, ഈ നിയമങ്ങൾ ഗവേഷകരെ നയിക്കാൻ കഴിയും, എന്നാൽ എല്ലാ സാഹചര്യങ്ങളിലും അവ ശരിയായിരിക്കണമെന്നില്ല.

P7 |പ്രൈമറിന്റെ 3′അന്ത്യം പ്രത്യേകതയിലോ കാര്യക്ഷമതയിലോ കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നില്ല.

A. മനുഷ്യ HIF-1α (NM_181054.2) ജീനിനുള്ള പ്രൈമറുകളുടെ സ്ഥാനം.

ബി. ആറ് ടെസ്റ്റ് ഇനങ്ങൾ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ എജിലന്റ് ബ്രില്യന്റ് III SYBR പച്ച മദർ മദ്യം (ക്യാറ്റ് നമ്പർ 600882) ഉപയോഗിക്കുക.

C. ബയോ-റാഡിന്റെ CFX qPCR ഉപകരണവും 3′end പ്രൈമറുകളും രേഖപ്പെടുത്തിയ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഗ്രാഫും ഉരുകൽ വക്രവും.NTC-കൾ ചുവപ്പ് നിറത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.

D. ഓരോ ടെസ്റ്റ് ഇനത്തിന്റെയും Cqs റെക്കോർഡ്

ഉദാഹരണത്തിന്, P 7 ലെ ഫലം 3′end റൂളിനെ എതിർക്കുന്നു.എല്ലാ ഡിസൈനുകളും അടിസ്ഥാനപരമായി ഒരേ ഫലങ്ങൾ നൽകുന്നു, രണ്ട് പ്രൈമർ കോമ്പിനേഷനുകൾ മാത്രം NTC-യിൽ നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷനിലേക്ക് നയിക്കുന്നു.

എന്നിരുന്നാലും, ഞങ്ങൾക്ക് GC ക്ലിപ്പിന്റെ ഫലത്തെ പിന്തുണയ്ക്കാൻ കഴിയില്ല, കാരണം ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, പരമാവധി 30 ബേസുകളായി A അല്ലെങ്കിൽ T ഉപയോഗിക്കുന്നത് പ്രത്യേകത കുറയ്ക്കില്ല.

GGCC-യിൽ F പ്രൈമർ അവസാനിക്കുന്ന ടെസ്റ്റ് C, NTC-കളിൽ Cqs റെക്കോർഡ് ചെയ്‌തു, 30-അവസാനത്തിൽ ഈ സീക്വൻസുകൾ ഒഴിവാക്കാൻ ഒരാൾ ആഗ്രഹിച്ചേക്കുമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ചില കാൻഡിഡേറ്റ് പ്രൈമറുകൾ പരീക്ഷണാത്മകമായി വിലയിരുത്തുക എന്നതാണ് പ്രൈമർ ജോഡിയുടെ ഏറ്റവും മികച്ച 3′അന്തം ക്രമം നിർണ്ണയിക്കാനുള്ള ഏക മാർഗം എന്ന് ഞങ്ങൾ ഊന്നിപ്പറയുന്നു.

ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത

പ്രധാനമായി, നോൺ-സ്പെസിഫിക് പിസിആർ ഡിറ്റക്ഷൻ ഒരിക്കലും നിർദ്ദിഷ്ടമാകില്ലെങ്കിലും, എൻസൈം, മാതൃമദ്യം, അഡിറ്റീവുകൾ, സൈക്ലിംഗ് അവസ്ഥകൾ എന്നിവ മാറ്റുന്നതിലൂടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത വ്യത്യസ്ത രീതികളിൽ ക്രമീകരിക്കാനും പരമാവധിയാക്കാനും കഴിയും.

പിസിആർ കണ്ടെത്തലിന്റെ കാര്യക്ഷമത വിലയിരുത്തുന്നതിന്, ടാർഗെറ്റ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡിന്റെ 10 അല്ലെങ്കിൽ 5 മടങ്ങ് സീരിയൽ നേർപ്പിക്കൽ ഉപയോഗിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്, അതായത്, "സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് രീതി".

ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് സൃഷ്ടിക്കാൻ PCR ആംപ്ലിക്കോണുകളോ സിന്തറ്റിക് ഡിഎൻഎ ടാർഗെറ്റുകളോ ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ, ഈ ടാർഗെറ്റുകളുടെ സീരിയൽ ഡൈല്യൂഷനുകൾ ഒരു സ്ഥിരമായ പശ്ചാത്തല ഡിഎൻഎയുമായി (ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ പോലുള്ളവ) കലർത്തണം.

P8 |പിസിആറിന്റെ കാര്യക്ഷമത വിലയിരുത്തുന്നതിനുള്ള ഡില്യൂഷൻ കർവ്.

A. PCR, ഉരുകൽ കർവ് അവസ്ഥകൾ എന്നിവയ്‌ക്കായി HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA, R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC, എജിലന്റ്സ് ബ്രില്യന്റ് III SYBR ഗ്രീൻ മാസ്റ്റർമിക്‌സ് (കാറ്റലോഗ് നമ്പർ 600882) എന്നിവയ്‌ക്കായി പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുക.

B. 100 ng RNA റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്തു, 2 തവണ നേർപ്പിച്ചു, തുടർച്ചയായി നേർപ്പിച്ച cDNA സാമ്പിളുകൾ 1 ng ഹ്യൂമൻ ജീനോമിക് ഡിഎൻഎയിലേക്ക് 5 തവണ നേർപ്പിച്ചു.ഉരുകുന്ന വക്രം ഇൻസെറ്റിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.

C. രണ്ടാമത്തെ cDNA സാമ്പിളിനായി RT പ്രതികരണം, നേർപ്പിക്കൽ, സീരിയൽ നേർപ്പിക്കൽ എന്നിവ ആവർത്തിച്ചു, ഫലങ്ങൾ സമാനമായിരുന്നു.

P 8 രണ്ട് സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവുകൾ കാണിക്കുന്നു, രണ്ട് വ്യത്യസ്ത സിഡിഎൻഎ സാമ്പിളുകളിൽ ഒരേ കണ്ടെത്തൽ രീതി ഉപയോഗിച്ച്, ഫലം ഒരേ കാര്യക്ഷമതയാണ്, ഏകദേശം 100%, കൂടാതെ R2 മൂല്യവും സമാനമാണ്, അതായത്, പരീക്ഷണാത്മക ഡാറ്റയും റിഗ്രഷൻ ലൈനും അല്ലെങ്കിൽ ഡാറ്റയുടെ രേഖീയതയുടെ ഡിഗ്രിയും തമ്മിലുള്ള ഫിറ്റ് ഡിഗ്രി.

രണ്ട് സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവുകൾ താരതമ്യപ്പെടുത്താവുന്നതാണ്, എന്നാൽ കൃത്യമായി ഒന്നുമല്ല.ലക്ഷ്യം കൃത്യമായി കണക്കാക്കുക എന്നതാണ് ഉദ്ദേശ്യമെങ്കിൽ, അനിശ്ചിതത്വം വിശദീകരിക്കാതെ ഒരു കോപ്പി നമ്പർ കണക്കുകൂട്ടൽ നൽകുന്നത് അസ്വീകാര്യമാണെന്ന് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്.

P9 |ഒരു സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് ഉപയോഗിച്ച് അളവെടുപ്പുമായി ബന്ധപ്പെട്ട അളക്കൽ അനിശ്ചിതത്വം.

എ. PCR, മെൽറ്റിംഗ് കർവ് അവസ്ഥകൾ എന്നിവ നടപ്പിലാക്കാൻ GAPDH (NM_002046) എന്നതിനായുള്ള പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുക.എഫ്.

B. ബയോ-റാഡിന്റെ CFX qPCR ഉപകരണം ഉപയോഗിച്ച് റെക്കോർഡ് ചെയ്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ചാർട്ട്, മെൽറ്റിംഗ് കർവ്, സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ്.

C. സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് ഗ്രാഫും 95% ആത്മവിശ്വാസ ഇടവേളയും (CI).

ഡി. ഡില്യൂഷൻ കർവിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ മൂന്ന് Cq മൂല്യങ്ങളുടെ പകർപ്പ് നമ്പറും 95% ആത്മവിശ്വാസ ഇടവേളയും.

ഒരു ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത ടെസ്റ്റിനായി, ഒരൊറ്റ സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവിന്റെ അന്തർലീനമായ വ്യതിയാനം ഏകദേശം 2 മടങ്ങ് (95% ആത്മവിശ്വാസ ഇടവേള, കുറഞ്ഞത് മുതൽ പരമാവധി വരെ) ആണെന്ന് P 9 കാണിക്കുന്നു, ഇത് പ്രതീക്ഷിക്കാവുന്ന ഏറ്റവും ചെറിയ വേരിയബിളിറ്റിയായിരിക്കാം.

അനുബന്ധ ഉൽപ്പന്നം:

സെൽ ഡയറക്ട് RT qPCR കിറ്റ്

മൗസ് ടെയിൽ ഡയറക്ട് പിസിആർ കിറ്റ്

അനിമൽ ടിഷ്യൂ ഡയറക്ട് പിസിആർ കിറ്റ്