1995-ൽ യുണൈറ്റഡ് സ്റ്റേറ്റ്സിലെ PE (പെർക്കിൻ എൽമർ) വികസിപ്പിച്ചെടുത്ത ഒരു പുതിയ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് ടെക്നോളജിയാണ് ഫ്ലൂറസെൻസ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR (TaqMan PCR എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു, ഇനി മുതൽ FQ-PCR എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു).ഫ്ലെക്‌സിബിൾ പിസിആറുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, എഫ്‌ക്യു-പിസിആറിന് അതിന്റെ അളവ് പ്രവർത്തനം തിരിച്ചറിയാൻ ധാരാളം ഗുണങ്ങളുണ്ട്.ഈ ലേഖനം സാങ്കേതികവിദ്യയുടെ സവിശേഷതകൾ, തത്വങ്ങൾ, രീതികൾ, പ്രയോഗങ്ങൾ എന്നിവ സംക്ഷിപ്തമായി വിവരിക്കാൻ ഉദ്ദേശിക്കുന്നു.

1 സവിശേഷതകൾ

FQ-PCR ന് സാധാരണ PCR-ന്റെ ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമത മാത്രമല്ല, ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബുകളുടെ പ്രയോഗവും കാരണം, ഫോട്ടോഇലക്ട്രിക് ചാലക സംവിധാനത്തിലൂടെ PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സമയത്ത് ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലിന്റെ മാറ്റം നേരിട്ട് കണ്ടുപിടിക്കാൻ കഴിയും, ഇത് പരമ്പരാഗത PCR-ന്റെ നിരവധി പോരായ്മകളെ മറികടക്കുന്നു.

ഉദാഹരണത്തിന്, അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ്, എഥിഡിയം ബ്രോമൈഡ് എന്നിവ അൾട്രാവയലറ്റ് ലൈറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് അല്ലെങ്കിൽ പോളിഅക്രിലാമൈഡ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ്, സിൽവർ സ്റ്റെയിനിംഗ് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് പൊതുവായ പിസിആർ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ നിരീക്ഷിക്കേണ്ടതുണ്ട്.ഇതിന് ഒന്നിലധികം ഉപകരണങ്ങൾ ആവശ്യമാണെന്ന് മാത്രമല്ല, സമയവും പരിശ്രമവും ആവശ്യമാണ്.എത്തിഡിയം ബ്രോമൈഡ് ഉപയോഗിച്ച പാടുകൾ മനുഷ്യശരീരത്തിന് ഹാനികരമാണ്, ഈ സങ്കീർണ്ണമായ പരീക്ഷണ നടപടിക്രമങ്ങൾ മലിനീകരണത്തിനും തെറ്റായ പോസിറ്റീവിനും അവസരമൊരുക്കുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, സാമ്പിൾ ലോഡിംഗ് സമയത്ത് FQ-PCR-ന് ഒരു തവണ മാത്രമേ ലിഡ് തുറക്കേണ്ടതുള്ളൂ, തുടർന്നുള്ള പ്രക്രിയ പൂർണ്ണമായും അടച്ച ട്യൂബ് പ്രവർത്തനമാണ്, ഇതിന് PCR പോസ്റ്റ്-പ്രോസസ്സിംഗ് ആവശ്യമില്ല, പരമ്പരാഗത PCR പ്രവർത്തനങ്ങളിലെ പല പോരായ്മകളും ഒഴിവാക്കുന്നു.പരീക്ഷണം സാധാരണയായി PE കമ്പനി വികസിപ്പിച്ച ABI7100 PCR തെർമൽ സൈക്ലർ ഉപയോഗിക്കുന്നു.

ഉപകരണത്തിന് ഇനിപ്പറയുന്ന സവിശേഷതകൾ ഉണ്ട്: ① വൈഡ് ആപ്ലിക്കേഷൻ: ഡിഎൻഎ, ആർഎൻഎ പിസിആർ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ അളവ്, ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ ഗവേഷണം, രോഗകാരി കണ്ടെത്തൽ, പിസിആർ അവസ്ഥകളുടെ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ എന്നിവയ്ക്കായി ഇത് ഉപയോഗിക്കാം.② അദ്വിതീയ അളവ് തത്വം: ഫ്ലൂറസെന്റ് ലേബൽ ചെയ്ത പ്രോബുകൾ ഉപയോഗിച്ച്, ഫ്ലൂറസെൻസിന്റെ അളവ് ലേസർ എക്‌സിറ്റേഷനുശേഷം പിസിആർ സൈക്കിളിനൊപ്പം ശേഖരിക്കപ്പെടും, അങ്ങനെ അളവെടുപ്പിന്റെ ഉദ്ദേശ്യം കൈവരിക്കാനാകും.③ ഉയർന്ന പ്രവർത്തനക്ഷമത: ബിൽറ്റ്-ഇൻ 9600 PCR തെർമൽ സൈക്ലർ, 96 സാമ്പിളുകളുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനും സ്വയമേവയും സമന്വയത്തോടെയും പൂർത്തിയാക്കാൻ കമ്പ്യൂട്ടർ 1 മുതൽ 2 മണിക്കൂർ വരെ നിയന്ത്രിക്കുന്നു.④ ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസിന്റെ ആവശ്യമില്ല: സാമ്പിൾ നേർപ്പിച്ച് ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ചെയ്യേണ്ടതില്ല, പ്രതികരണ ട്യൂബിൽ നേരിട്ട് കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഒരു പ്രത്യേക അന്വേഷണം ഉപയോഗിക്കുക.⑤പൈപ്പ്‌ലൈനിൽ മലിനീകരണമില്ല: പൂർണ്ണമായി അടച്ചിരിക്കുന്ന തനത് റിയാക്ഷൻ ട്യൂബും ഫോട്ടോ ഇലക്ട്രിക് കണ്ടക്ഷൻ സിസ്റ്റവും സ്വീകരിച്ചു, അതിനാൽ മലിനീകരണത്തെക്കുറിച്ച് വിഷമിക്കേണ്ടതില്ല.⑥ഫലങ്ങൾ പുനർനിർമ്മിക്കാവുന്നവയാണ്: ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് ഡൈനാമിക് ശ്രേണി അഞ്ച് ഓർഡറുകൾ വരെയാണ്.അതിനാൽ, ഈ സാങ്കേതികവിദ്യ വിജയകരമായി വികസിപ്പിച്ചതിനാൽ, നിരവധി ശാസ്ത്ര ഗവേഷകർ ഇത് വിലമതിക്കുകയും പല മേഖലകളിൽ പ്രയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു.

2 തത്വങ്ങളും രീതികളും

പിസിആർ റിയാക്ഷൻ സിസ്റ്റത്തിലേക്ക് ഫ്ലൂറസന്റ് ലേബൽ ചെയ്‌ത അന്വേഷണം ചേർക്കുന്നതിന് ടാക് എൻസൈമിന്റെ 5′→3′ എക്‌സോണ്യൂക്ലീസ് പ്രവർത്തനം ഉപയോഗിക്കുക എന്നതാണ് FQ-PCR-ന്റെ പ്രവർത്തന തത്വം.പ്രൈമർ സീക്വൻസിലുള്ള ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് പ്രോബിന് പ്രത്യേകമായി ഹൈബ്രിഡൈസ് ചെയ്യാൻ കഴിയും.അന്വേഷണത്തിന്റെ 5-അവസാനം ഫ്ലൂറസെൻസ് എമിഷൻ ജീൻ FAM (6-കാർബോക്‌സിഫ്ലൂറസെൻ, ഫ്ലൂറസെൻസ് എമിഷൻ പീക്ക് 518nm) ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്‌തിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ 3' അവസാനം ഫ്ലൂറസെൻസ് ക്വഞ്ചിംഗ് ഗ്രൂപ്പ് TAMRA (6-കാർബോക്‌സൈറ്റെൻസെറ്റ്‌മെതൈൽമെതൈൽ 3), പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സമയത്ത് അന്വേഷണം നീട്ടുന്നത് തടയാൻ പ്രോബിന്റെ ആരംഭം ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് ആണ്.അന്വേഷണം കേടുകൂടാതെയിരിക്കുമ്പോൾ, ക്വഞ്ചർ ഗ്രൂപ്പ് എമിറ്റിംഗ് ഗ്രൂപ്പിന്റെ ഫ്ലൂറസെൻസ് ഉദ്വമനത്തെ അടിച്ചമർത്തുന്നു.എമിറ്റിംഗ് ഗ്രൂപ്പിനെ ക്വഞ്ചിംഗ് ഗ്രൂപ്പിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചുകഴിഞ്ഞാൽ, ഇൻഹിബിഷൻ ഉയർത്തി, 518nm-ൽ ഒപ്റ്റിക്കൽ സാന്ദ്രത വർദ്ധിക്കുകയും ഫ്ലൂറസെൻസ് ഡിറ്റക്ഷൻ സിസ്റ്റം വഴി കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്യുന്നു. പുനർനിർമ്മാണ ഘട്ടത്തിൽ, ടെംപ്ലേറ്റ് ഡിഎൻഎയുമായി പ്രോബ് ഹൈബ്രിഡൈസ് ചെയ്യുന്നു, കൂടാതെ വിപുലീകരണ ഘട്ടത്തിൽ ടാക് എൻസൈം ഡിഎൻഎയുടെ പ്രൈം ടെംപ്ലേറ്റിനൊപ്പം നീങ്ങുന്നു.അന്വേഷണം മുറിക്കുമ്പോൾ, ക്വഞ്ചിംഗ് ഇഫക്റ്റ് പുറത്തുവിടുകയും ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നൽ പുറത്തുവിടുകയും ചെയ്യുന്നു.ഓരോ തവണയും ടെംപ്ലേറ്റ് പകർത്തുമ്പോൾ, ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലിന്റെ പ്രകാശനത്തോടൊപ്പം ഒരു അന്വേഷണം മുറിക്കുന്നു.റിലീസ് ചെയ്ത ഫ്ലൂറോഫോറുകളുടെ എണ്ണവും പിസിആർ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ എണ്ണവും തമ്മിൽ പരസ്പരം ബന്ധമുള്ളതിനാൽ, ടെംപ്ലേറ്റ് കൃത്യമായി കണക്കാക്കാൻ ഈ സാങ്കേതികവിദ്യ ഉപയോഗിക്കാം.പരീക്ഷണാത്മക ഉപകരണം സാധാരണയായി PE കമ്പനി വികസിപ്പിച്ച ABI7100 PCR തെർമൽ സൈക്ലർ ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ മറ്റ് തെർമൽ സൈക്ലറുകളും ഉപയോഗിക്കാം.എബിഐ7700 റിയാക്ഷൻ ടൈപ്പ് റിയാക്ഷൻ സിസ്റ്റം ആണ് പരീക്ഷണത്തിനായി ഉപയോഗിക്കുന്നതെങ്കിൽ, പ്രതികരണം പൂർത്തിയായ ശേഷം, കമ്പ്യൂട്ടർ വിശകലനത്തിലൂടെ അളവ് ഫലങ്ങൾ നേരിട്ട് നൽകാം.നിങ്ങൾ മറ്റ് തെർമൽ സൈക്ലറുകൾ ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ, RQ+, RQ-, △RQ എന്നിവ കണക്കാക്കാൻ ഒരേ സമയം പ്രതികരണ ട്യൂബിലെ ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നൽ അളക്കാൻ നിങ്ങൾ ഒരു ഫ്ലൂറസെൻസ് ഡിറ്റക്ടർ ഉപയോഗിക്കേണ്ടതുണ്ട്.സാമ്പിൾ ട്യൂബിന്റെ ഫ്ലൂറസെന്റ് എമിഷൻ ഗ്രൂപ്പിന്റെ ലുമിനസെൻസ് തീവ്രതയും ക്വഞ്ചിംഗ് ഗ്രൂപ്പിന്റെ ലുമിനസെൻസ് തീവ്രതയും തമ്മിലുള്ള അനുപാതത്തെ RQ+ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, RQ- ബ്ലാങ്ക് ട്യൂബിലെ രണ്ടിന്റെയും അനുപാതത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) എന്നത് പിസിയുടെ ഫ്‌ളൂറസെന്റ് പ്രക്രിയയ്‌ക്ക് ശേഷം ലഭിക്കുന്ന സിഗ്നൽ മാറ്റത്തിന്റെ അളവിനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബുകളുടെ ആമുഖം കാരണം, പരീക്ഷണത്തിന്റെ പ്രത്യേകത ഗണ്യമായി മെച്ചപ്പെട്ടു.പ്രോബ് ഡിസൈൻ സാധാരണയായി ഇനിപ്പറയുന്ന വ്യവസ്ഥകൾ പാലിക്കണം: ①ബൈൻഡിംഗിന്റെ പ്രത്യേകത ഉറപ്പാക്കാൻ പ്രോബിന്റെ നീളം ഏകദേശം 20-40 ബേസുകൾ ആയിരിക്കണം.②സിങ്കിൾ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് സീക്വൻസുകളുടെ തനിപ്പകർപ്പ് ഒഴിവാക്കാൻ ജിസി ബേസുകളുടെ ഉള്ളടക്കം 40% മുതൽ 60% വരെയാണ്.③ ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ ഒഴിവാക്കുക അല്ലെങ്കിൽ പ്രൈമറുകളുമായി ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുക.④ പ്രോബും ടെംപ്ലേറ്റും തമ്മിലുള്ള ബൈൻഡിംഗിന്റെ സ്ഥിരത പ്രൈമറിനും ടെംപ്ലേറ്റിനും ഇടയിലുള്ള ബൈൻഡിംഗിന്റെ സ്ഥിരതയേക്കാൾ കൂടുതലാണ്, അതിനാൽ പ്രോബിന്റെ Tm മൂല്യം പ്രൈമറിന്റെ Tm മൂല്യത്തേക്കാൾ കുറഞ്ഞത് 5 ° C കൂടുതലായിരിക്കണം.കൂടാതെ, അന്വേഷണത്തിന്റെ ഏകാഗ്രത, അന്വേഷണവും ടെംപ്ലേറ്റ് ക്രമവും തമ്മിലുള്ള ഹോമോളജി, അന്വേഷണവും പ്രൈമറും തമ്മിലുള്ള ദൂരം എന്നിവയെല്ലാം പരീക്ഷണ ഫലങ്ങളിൽ സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നു.

ബന്ധപ്പെട്ട ഉല്പന്നങ്ങൾ:

China Lnc-RT Heroᵀᴹ I(gDNase-നൊപ്പം)(lncRNA-യിൽ നിന്നുള്ള ആദ്യ-സ്ട്രാൻഡ് cDNA സിന്തസിസിനായുള്ള സൂപ്പർ പ്രീമിക്സ്) നിർമ്മാതാവും വിതരണക്കാരനും |ഫോർജീൻ (foreivd.com)

ചൈന റിയൽ ടൈം PCR Easyᵀᴹ-Taqman നിർമ്മാതാവും വിതരണക്കാരനും |ഫോർജീൻ (foreivd.com)