• ചെറിയ അളവിലുള്ള ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റിൽ നിന്ന് ഡിഎൻഎ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു രീതിയാണ് പിസിആർ.RT-PCR റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഉപയോഗിച്ച് ഒരു RNA ഉറവിടത്തിൽ നിന്ന് ഒരു ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റ് നിർമ്മിക്കുന്നു, അത് പിന്നീട് വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.
• PCR, RT-PCR എന്നിവ സാധാരണയായി എൻഡ്‌പോയിന്റ് പ്രതികരണങ്ങളാണ്, അതേസമയം qPCR, RT-qPCR എന്നിവ PCR പ്രതികരണ സമയത്ത് നിലവിലുള്ള ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ അളവ് കണക്കാക്കാൻ ഉൽപ്പന്ന സമന്വയത്തിന്റെ നിരക്കിന്റെ ചലനാത്മകത ഉപയോഗിക്കുന്നു.
• ഡിജിറ്റൽ പിസിആർ പോലെയുള്ള പുതിയ രീതികൾ, പ്രാരംഭ ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ സമ്പൂർണ്ണ അളവ് നൽകുന്നു, അതേസമയം ഐസോതെർമൽ പിസിആർ പോലുള്ള രീതികൾ വിശ്വസനീയമായ ഫലങ്ങൾ നൽകുന്നതിന് വിലകൂടിയ ഉപകരണങ്ങളുടെ ആവശ്യകത കുറയ്ക്കുന്നു.

ഡിഎൻഎ, ആർഎൻഎ സീക്വൻസുകൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും കണ്ടെത്തുന്നതിനും താരതമ്യേന ലളിതവും വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നതുമായ മോളിക്യുലാർ ബയോളജി സാങ്കേതികതയാണ് പോളിമറേസ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ (പിസിആർ).ഡിഎൻഎ ക്ലോണിംഗിന്റെയും ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെയും പരമ്പരാഗത രീതികളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, പലപ്പോഴും ദിവസങ്ങൾ എടുത്തേക്കാം, PCR-ന് കുറച്ച് മണിക്കൂറുകൾ മാത്രമേ ആവശ്യമുള്ളൂ.PCR വളരെ സെൻസിറ്റീവ് ആണ്, കൂടാതെ നിർദ്ദിഷ്ട സീക്വൻസുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിനും വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ ടെംപ്ലേറ്റ് ആവശ്യമാണ്.ലളിതമായ ഡിഎൻഎ, ആർഎൻഎ കണ്ടെത്തലിൽ നിന്ന് അടിസ്ഥാന PCR രീതികൾ കൂടുതൽ പുരോഗമിച്ചു.നിങ്ങളുടെ ഗവേഷണ ആവശ്യങ്ങൾക്കായി എൻസോ ലൈഫ് സയൻസസിൽ ഞങ്ങൾ നൽകുന്ന വ്യത്യസ്ത പിസിആർ രീതികളുടെയും റിയാക്ടറുകളുടെയും ഒരു അവലോകനം ചുവടെ ഞങ്ങൾ നൽകിയിട്ടുണ്ട്.ശാസ്ത്രജ്ഞരെ അവരുടെ അടുത്ത ഗവേഷണ പ്രോജക്റ്റിൽ ഉപയോഗിക്കാൻ PCR റിയാക്ടറുകൾ വേഗത്തിൽ ആക്സസ് ചെയ്യാൻ സഹായിക്കുകയാണ് ഞങ്ങൾ ലക്ഷ്യമിടുന്നത്!

പിസിആർ

സ്റ്റാൻഡേർഡ് പിസിആറിന്, നിങ്ങൾക്ക് വേണ്ടത് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ്, മഗ്നീഷ്യം, ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ, പ്രൈമറുകൾ, ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്യേണ്ട ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റ്, ഒരു തെർമോസൈക്ലർ എന്നിവയാണ്.പിസിആർ മെക്കാനിസം അതിന്റെ ഉദ്ദേശ്യം പോലെ ലളിതമാണ്: 1) ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ (ഡിഎസ്ഡിഎൻഎ) ഹീറ്റ് ഡിനേച്ചർഡ് ആണ്, 2) പ്രൈമറുകൾ സിംഗിൾ ഡിഎൻഎ സ്ട്രാൻഡുകളിലേക്ക് വിന്യസിക്കുന്നു, 3) ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് ഉപയോഗിച്ച് പ്രൈമറുകൾ വിപുലീകരിക്കുന്നു, അതിന്റെ ഫലമായി രണ്ട് പകർപ്പുകൾ ഉണ്ടാകുന്നു. യഥാർത്ഥ DNA സ്ട്രാൻഡ്.താപനിലകളുടെയും സമയങ്ങളുടെയും ഒരു ശ്രേണിയിലെ ഡീനാറ്ററേഷൻ, അനീലിംഗ്, നീട്ടൽ പ്രക്രിയയെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ ഒരു ചക്രം എന്ന് വിളിക്കുന്നു (ചിത്രം 1).

ഉപയോഗിച്ച ടെംപ്ലേറ്റിനും പ്രൈമർ സെറ്റിനും വേണ്ടി സൈക്കിളിന്റെ ഓരോ ഘട്ടവും ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യണം.ഈ ചക്രം ഏകദേശം 20-40 തവണ ആവർത്തിക്കുന്നു, തുടർന്ന് ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നം വിശകലനം ചെയ്യാം, സാധാരണയായി അഗറോസ് ജെൽ (ചിത്രം 2).

PCR വളരെ സെൻസിറ്റീവ് ആയ ഒരു രീതിയായതിനാലും ഒറ്റ പ്രതികരണങ്ങൾക്ക് വളരെ ചെറിയ അളവുകൾ ആവശ്യമുള്ളതിനാലും, നിരവധി പ്രതികരണങ്ങൾക്കായി ഒരു മാസ്റ്റർ മിശ്രിതം തയ്യാറാക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.മാസ്റ്റർ മിക്‌സ് നന്നായി കലർത്തി പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളുടെ എണ്ണം കൊണ്ട് വിഭജിക്കണം, ഓരോ പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിലും ഒരേ അളവിൽ എൻസൈം, ഡിഎൻടിപികൾ, പ്രൈമറുകൾ എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നുവെന്ന് ഉറപ്പാക്കണം.എൻസോ ലൈഫ് സയൻസസ് പോലുള്ള പല വിതരണക്കാരും, പ്രൈമറുകളും ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റും ഒഴികെയുള്ള എല്ലാം ഇതിനകം ഉൾക്കൊള്ളുന്ന പിസിആർ മിക്സുകളും വാഗ്ദാനം ചെയ്യുന്നു.

ഗ്വാനിൻ/സൈറ്റോസിൻ സമ്പന്നമായ (ജിസി-സമ്പന്നമായ) പ്രദേശങ്ങൾ സ്റ്റാൻഡേർഡ് പിസിആർ ടെക്നിക്കുകളിൽ ഒരു വെല്ലുവിളിയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.കുറഞ്ഞ ജിസി ഉള്ളടക്കമുള്ള സീക്വൻസുകളേക്കാൾ ജിസി-റിച്ച് സീക്വൻസുകൾ കൂടുതൽ സ്ഥിരതയുള്ളതാണ്.കൂടാതെ, ജിസി-റിച്ച് സീക്വൻസുകൾ ഹെയർപിൻ ലൂപ്പുകൾ പോലെയുള്ള ദ്വിതീയ ഘടനകൾ ഉണ്ടാക്കുന്നു.തൽഫലമായി, ഡീനാറ്ററേഷൻ ഘട്ടത്തിൽ ജിസി സമ്പുഷ്ടമായ ഇരട്ട സ്ട്രോണ്ടുകൾ പൂർണ്ണമായും വേർതിരിക്കുന്നത് ബുദ്ധിമുട്ടാണ്.തൽഫലമായി, ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന് തടസ്സമില്ലാതെ പുതിയ സ്ട്രോണ്ടിനെ സമന്വയിപ്പിക്കാൻ കഴിയില്ല.ഉയർന്ന ഡീനാറ്ററേഷൻ താപനില ഇത് മെച്ചപ്പെടുത്തും, കൂടാതെ ഉയർന്ന അനീലിംഗ് താപനിലയിലേക്കും കുറഞ്ഞ അനീലിംഗ് സമയത്തിലേക്കുമുള്ള ക്രമീകരണങ്ങൾക്ക് ജിസി-റിച്ച് പ്രൈമറുകളുടെ അവ്യക്തമായ ബൈൻഡിംഗ് തടയാനാകും.അധിക റിയാഗന്റുകൾക്ക് ജിസി-റിച്ച് സീക്വൻസുകളുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.ഡിഎംഎസ്ഒ, ഗ്ലിസറോൾ, ബീറ്റൈൻ എന്നിവ ജിസി ഇടപെടലുകൾ മൂലമുണ്ടാകുന്ന ദ്വിതീയ ഘടനകളെ തടസ്സപ്പെടുത്താനും അതുവഴി ഇരട്ട സ്ട്രോണ്ടുകളുടെ വേർതിരിവ് സുഗമമാക്കാനും സഹായിക്കുന്നു.

Hot Start PCR

പിസിആർ സമയത്ത് സംഭവിക്കാവുന്ന ഒരു പ്രശ്നമാണ് അൺസ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ.PCR-ന് ഉപയോഗിക്കുന്ന മിക്ക ഡിഎൻഎ പോളിമറേസുകളും 68°C മുതൽ 72°C വരെയുള്ള താപനിലയിൽ മികച്ച രീതിയിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, എൻസൈമിന് താഴ്ന്ന താപനിലയിലും സജീവമായി പ്രവർത്തിക്കാൻ കഴിയും, കുറഞ്ഞ അളവിലാണെങ്കിലും.അനീലിംഗ് താപനിലയേക്കാൾ വളരെ താഴെയുള്ള താപനിലയിൽ, പ്രൈമറുകൾ നോൺ-സ്പെസിഫിക്കായി ബൈൻഡ് ചെയ്യുകയും നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷനിലേക്ക് നയിക്കുകയും ചെയ്യും, പ്രതിപ്രവർത്തനം ഹിമത്തിൽ സജ്ജീകരിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിലും.ഒരു നിശ്ചിത ഊഷ്മാവിൽ എത്തിക്കഴിഞ്ഞാൽ മാത്രം ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിൽ നിന്ന് വേർപെടുത്തുന്ന പോളിമറേസ് ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇത് തടയാം, അതിനാൽ ഹോട്ട് സ്റ്റാർട്ട് പിസിആർ എന്ന പദം.ഇൻഹിബിറ്ററിന് പോളിമറേസിനെ ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന ഒരു ആന്റിബോഡിയാകാം, പ്രാരംഭ ഡിനാറ്ററേഷൻ താപനിലയിൽ (സാധാരണയായി 95 ° C).

ഉയർന്ന ഫിഡിലിറ്റി പോളിമറേസ്

ഡിഎൻഎ പോളിമറേസുകൾ യഥാർത്ഥ ടെംപ്ലേറ്റ് ശ്രേണിയിലേക്ക് വളരെ കൃത്യമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുമ്പോൾ, ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് പൊരുത്തപ്പെടുത്തലിൽ തെറ്റുകൾ സംഭവിക്കാം.ക്ലോണിംഗ് പോലുള്ള പ്രയോഗങ്ങളിലെ പൊരുത്തക്കേടുകൾ വെട്ടിച്ചുരുക്കിയ ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്റ്റുകൾക്കും തെറ്റായി വിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെടുകയോ നിർജ്ജീവമായ പ്രോട്ടീനുകൾ താഴോട്ട് നയിക്കുകയോ ചെയ്യും.ഈ പൊരുത്തക്കേടുകൾ ഒഴിവാക്കാൻ, "പ്രൂഫ് റീഡിംഗ്" പ്രവർത്തനമുള്ള പോളിമറേസുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞ് വർക്ക്ഫ്ലോയിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.ആദ്യത്തെ പ്രൂഫ് റീഡിംഗ് പോളിമറേസ്, Pfu, 1991 ൽ പൈറോകോക്കസ് ഫ്യൂറിയോസസിൽ കണ്ടെത്തി.ഈ Pfu എൻസൈമിന് 3' മുതൽ 5' വരെ എക്സോന്യൂക്ലീസ് പ്രവർത്തനമുണ്ട്.ഡിഎൻഎ ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്യപ്പെടുന്നതിനാൽ, സ്ട്രോണ്ടിന്റെ 3' അറ്റത്തുള്ള പൊരുത്തമില്ലാത്ത ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ എക്സോന്യൂക്ലീസ് നീക്കം ചെയ്യുന്നു.ശരിയായ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് പിന്നീട് മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുകയും ഡിഎൻഎ സമന്വയം തുടരുകയും ചെയ്യുന്നു.തെറ്റായ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് സീക്വൻസുകളുടെ തിരിച്ചറിയൽ എൻസൈമുമായുള്ള ശരിയായ ന്യൂക്ലിയോസൈഡ് ട്രൈഫോസ്ഫേറ്റുമായുള്ള ബന്ധത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്, ഇവിടെ കാര്യക്ഷമമല്ലാത്ത ബൈൻഡിംഗ് സമന്വയത്തെ മന്ദഗതിയിലാക്കുകയും ശരിയായ മാറ്റിസ്ഥാപിക്കാൻ അനുവദിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.Pfu പോളിമറേസിന്റെ പ്രൂഫ് റീഡിംഗ് പ്രവർത്തനം, Taq DNA പോളിമറേസുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ അവസാന ശ്രേണിയിൽ കുറച്ച് പിശകുകൾക്ക് കാരണമാകുന്നു.സമീപ വർഷങ്ങളിൽ, മറ്റ് പ്രൂഫ് റീഡിംഗ് എൻസൈമുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്, ഡിഎൻഎ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സമയത്ത് പിശക് നിരക്ക് കൂടുതൽ കുറയ്ക്കുന്നതിന് യഥാർത്ഥ Pfu എൻസൈമിന്റെ പരിഷ്ക്കരണങ്ങൾ വരുത്തിയിട്ടുണ്ട്.

ആർടി-പിസിആർ

റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ PCR, അല്ലെങ്കിൽ RT-PCR, ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി RNA ഉപയോഗിക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു.ഒരു അധിക ഘട്ടം RNA കണ്ടുപിടിക്കുന്നതിനും വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും അനുവദിക്കുന്നു.റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ഉപയോഗിച്ച് ആർഎൻഎ കോംപ്ലിമെന്ററി ഡിഎൻഎയിലേക്ക് (സിഡിഎൻഎ) റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്യുന്നു.ആർ‌എൻ‌എ ടെം‌പ്ലേറ്റിന്റെ ഗുണനിലവാരവും പരിശുദ്ധിയും ആർ‌ടി-പി‌സി‌ആറിന്റെ വിജയത്തിന് അത്യന്താപേക്ഷിതമാണ്.ആർടി-പിസിആറിന്റെ ആദ്യപടി ഡിഎൻഎ/ആർഎൻഎ ഹൈബ്രിഡിന്റെ സമന്വയമാണ്.റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിന് ഒരു RNase H ഫംഗ്ഷനും ഉണ്ട്, ഇത് ഹൈബ്രിഡിന്റെ RNA ഭാഗത്തെ തരംതാഴ്ത്തുന്നു.റിവേഴ്‌സ് ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്റ്റേസിന്റെ ഡിഎൻഎ-ആശ്രിത ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനത്തിലൂടെ സിഡിഎൻഎയിലേക്ക് സിംഗിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ തന്മാത്ര പൂർത്തിയാക്കുന്നു.ആദ്യ-സ്ട്രാൻഡ് പ്രതികരണത്തിന്റെ കാര്യക്ഷമത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രക്രിയയെ ബാധിക്കും.ഇവിടെ നിന്ന്, സിഡിഎൻഎ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് സാധാരണ PCR നടപടിക്രമം ഉപയോഗിക്കുന്നു.ആർ‌എൻ‌എയെ സി‌ഡി‌എൻ‌എ ആക്കി ആർ‌ടി-പി‌സി‌ആർ പുനഃസ്ഥാപിക്കാനുള്ള സാധ്യതയ്ക്ക് നിരവധി ഗുണങ്ങളുണ്ട്, ഇത് പ്രാഥമികമായി ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വിശകലനത്തിനായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.ആർ‌എൻ‌എ ഒറ്റ-ധാരയുള്ളതും വളരെ അസ്ഥിരവുമാണ്, ഇത് പ്രവർത്തിക്കുന്നത് വെല്ലുവിളിയാക്കുന്നു.ഇത് സാധാരണയായി qPCR ന്റെ ആദ്യ പടിയായി വർത്തിക്കുന്നു, ഇത് ഒരു ബയോളജിക്കൽ സാമ്പിളിലെ RNA ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളെ അളക്കുന്നു.

qPCR, RT-qPCR എന്നിവ

നിരവധി ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്കായി ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിനും സ്വഭാവം നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനും അളക്കുന്നതിനും ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ (qPCR) ഉപയോഗിക്കുന്നു.RT-qPCR-ൽ, മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ ആദ്യം cDNA-യിലേക്ക് റിവേഴ്‌സ് ട്രാൻസ്‌ക്രൈബ് ചെയ്‌ത് RNA ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്റ്റുകൾ പലപ്പോഴും അളക്കുന്നു, തുടർന്ന് qPCR പിന്നീട് നടപ്പിലാക്കുന്നു.സ്റ്റാൻഡേർഡ് പി‌സി‌ആറിലെന്നപോലെ, ഡി‌എൻ‌എ മൂന്ന് ആവർത്തിച്ചുള്ള ഘട്ടങ്ങളിലൂടെ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു: ഡിനാറ്ററേഷൻ, അനീലിംഗ്, നീട്ടൽ.എന്നിരുന്നാലും, qPCR-ൽ, PCR പുരോഗമിക്കുന്നതിനനുസരിച്ച് ഫ്ലൂറസെന്റ് ലേബലിംഗ് ഡാറ്റ ശേഖരണം സാധ്യമാക്കുന്നു.ലഭ്യമായ രീതികളുടെയും രസതന്ത്രങ്ങളുടെയും ശ്രേണി കാരണം ഈ സാങ്കേതികവിദ്യയ്ക്ക് ധാരാളം ഗുണങ്ങളുണ്ട്.

ഡൈ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള qPCR-ൽ (സാധാരണയായി പച്ച), ഫ്ലൂറസെന്റ് ലേബലിംഗ് ഒരു dsDNA ബൈൻഡിംഗ് ഡൈ ഉപയോഗിച്ച് വർദ്ധിപ്പിച്ച DNA തന്മാത്രകളുടെ അളവ് നിർണ്ണയിക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു.ഓരോ സൈക്കിളിലും, ഫ്ലൂറസെൻസ് അളക്കുന്നു.ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നൽ പകർപ്പെടുക്കുന്ന ഡിഎൻഎയുടെ അളവിന് ആനുപാതികമായി വർദ്ധിക്കുന്നു.അതിനാൽ, ഡിഎൻഎ "തത്സമയ" (ചിത്രം 3) കണക്കാക്കുന്നു.ഡൈ-ബേസ്ഡ് qPCR-ന്റെ ദോഷങ്ങൾ, ഒരു സമയം ഒരു ടാർഗെറ്റ് മാത്രമേ പരിശോധിക്കാൻ കഴിയൂ എന്നതും സാമ്പിളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന ഏതെങ്കിലും ds-DNA-യുമായി ചായം ബന്ധിപ്പിക്കും എന്നതാണ്.

പ്രോബ് അധിഷ്‌ഠിത qPCR-ൽ, ഓരോ സാമ്പിളിലും ഒരേസമയം നിരവധി ടാർഗെറ്റുകൾ കണ്ടെത്താനാകും, എന്നാൽ ഇതിന് പ്രൈമറുകൾക്ക് പുറമേ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു ടാർഗെറ്റ്-നിർദ്ദിഷ്‌ട പ്രോബിന്റെ(കൾ) ഒപ്റ്റിമൈസേഷനും രൂപകൽപ്പനയും ആവശ്യമാണ്.നിരവധി തരം പ്രോബ് ഡിസൈനുകൾ ലഭ്യമാണ്, എന്നാൽ ഏറ്റവും സാധാരണമായ തരം ഒരു ഹൈഡ്രോളിസിസ് പ്രോബ് ആണ്, അതിൽ ഫ്ലൂറോഫോറും ക്വൻസറും ഉൾപ്പെടുന്നു.ഫ്ലൂറസെൻസ് റിസോണൻസ് എനർജി ട്രാൻസ്ഫർ (FRET) പ്രോബ് കേടുകൂടാതെയിരിക്കുമ്പോൾ, ഫ്ലൂറോഫോറിന്റെ ഉദ്വമനം തടയുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, പിസിആർ പ്രതികരണ സമയത്ത്, പ്രൈമർ എക്സ്റ്റൻഷനിലും അത് ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന നിർദ്ദിഷ്ട ശ്രേണിയുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനിലും പ്രോബ് ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യപ്പെടുന്നു.അന്വേഷണത്തിന്റെ പിളർപ്പ് ഫ്ലൂറോഫോറിനെ ക്വൻസറിൽ നിന്ന് വേർതിരിക്കുകയും ഫ്ലൂറസെൻസിൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ-ആശ്രിത വർദ്ധനവിന് കാരണമാകുകയും ചെയ്യുന്നു (ചിത്രം 4).അതിനാൽ, ഒരു പ്രോബ് അധിഷ്ഠിത qPCR പ്രതികരണത്തിൽ നിന്നുള്ള ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നൽ സാമ്പിളിലുള്ള പ്രോബ് ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസിൻറെ അളവിന് ആനുപാതികമാണ്.പ്രോബ് അധിഷ്ഠിത qPCR ഡൈ-ബേസ്ഡ് qPCR-നേക്കാൾ കൂടുതൽ നിർദ്ദിഷ്ടമായതിനാൽ, qPCR അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് പരിശോധനകളിൽ ഇത് പലപ്പോഴും സാങ്കേതികവിദ്യയാണ്.

ഐസോതെർമൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ

ഡീനാറ്ററേഷൻ, അനീലിംഗ്, എക്സ്റ്റൻഷൻ സ്റ്റെപ്പുകൾ എന്നിവയ്‌ക്കായി ചേമ്പറിന്റെ താപനില കൃത്യമായി ഉയർത്താനും താഴാനും മുകളിൽ സൂചിപ്പിച്ച പിസിആറിന് വിലകൂടിയ തെർമോസൈക്ലിംഗ് ഉപകരണങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്.അത്തരം കൃത്യമായ ഉപകരണങ്ങൾ ആവശ്യമില്ലാത്ത നിരവധി സാങ്കേതിക വിദ്യകൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ ലളിതമായ വാട്ടർ ബാത്തിൽ അല്ലെങ്കിൽ താൽപ്പര്യമുള്ള സെല്ലുകളിൽ പോലും ഇത് ചെയ്യാൻ കഴിയും.ഈ സങ്കേതങ്ങളെ മൊത്തത്തിൽ ഐസോതെർമൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ എന്ന് വിളിക്കുന്നു കൂടാതെ എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ, ലീനിയർ അല്ലെങ്കിൽ കാസ്‌കേഡ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ എന്നിവയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി പ്രവർത്തിക്കുന്നു.

ഐസോതെർമൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ ഏറ്റവും അറിയപ്പെടുന്ന തരം ലൂപ്പ്-മെഡിയേറ്റഡ് ഐസോതെർമൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ അല്ലെങ്കിൽ LAMP ആണ്.ടെംപ്ലേറ്റ് DNA അല്ലെങ്കിൽ RNA വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ LAMP 65⁰C-ൽ എക്സ്പോണൻഷ്യൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു.LAMP നിർവ്വഹിക്കുമ്പോൾ, പുതിയ ഡിഎൻഎ സമന്വയിപ്പിക്കാൻ ലക്ഷ്യമിട്ടുള്ള ഡിഎൻഎയുടെ പ്രദേശങ്ങളുമായി പൂരകമായ നാലോ ആറോ പ്രൈമറുകൾ ഒരു ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിനൊപ്പം ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഈ രണ്ട് പ്രൈമറുകൾക്ക് കോംപ്ലിമെന്ററി സീക്വൻസുകൾ ഉണ്ട്, അത് മറ്റ് പ്രൈമറുകളിലെ സീക്വൻസുകൾ തിരിച്ചറിയുകയും അവയെ ബന്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് പുതുതായി സമന്വയിപ്പിച്ച ഡിഎൻഎയിൽ ഒരു "ലൂപ്പ്" ഘടന രൂപപ്പെടാൻ അനുവദിക്കുന്നു, അത് തുടർന്നുള്ള ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ റൗണ്ടുകളിൽ പ്രൈമർ അനീലിംഗിനെ സഹായിക്കുന്നു.ഫ്ലൂറസെൻസ്, അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് അല്ലെങ്കിൽ കളർമെട്രി എന്നിവയുൾപ്പെടെ ഒന്നിലധികം രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് ലാമ്പ് ദൃശ്യവൽക്കരിക്കാൻ കഴിയും.കളർമെട്രിയിലൂടെ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ സാന്നിധ്യമോ അഭാവമോ ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നതിനും കണ്ടെത്തുന്നതിനുമുള്ള എളുപ്പവും വിലകൂടിയ ഉപകരണങ്ങളുടെ അഭാവവും ക്ലിനിക്കൽ ലാബ് പരിശോധന ലഭ്യമല്ലാത്ത സ്ഥലങ്ങളിൽ SARS-CoV-2 പരിശോധനയ്‌ക്ക് അനുയോജ്യമായ ഓപ്ഷനായി LAMP-നെ മാറ്റി, അല്ലെങ്കിൽ സാമ്പിളുകളുടെ സംഭരണവും ഗതാഗതവും. പ്രായോഗികമായിരുന്നില്ല, അല്ലെങ്കിൽ മുമ്പ് PCR തെർമോസൈക്ലിംഗ് ഉപകരണങ്ങൾ ഇല്ലാതിരുന്ന ലാബുകളിൽ.