1. അടിസ്ഥാന അറിവ് (നിങ്ങൾക്ക് പരീക്ഷണാത്മക ഭാഗം കാണണമെങ്കിൽ, രണ്ടാം ഭാഗത്തേക്ക് നേരിട്ട് കൈമാറുക)

പരമ്പരാഗത പിസിആറിന്റെ ഒരു ഡെറിവേറ്റീവ് പ്രതികരണമെന്ന നിലയിൽ, ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നലിന്റെ മാറ്റത്തിലൂടെ പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന്റെ ഓരോ സൈക്കിളിലുമുള്ള ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ അളവിലെ മാറ്റം തത്സമയ പിസിആർ പ്രധാനമായും നിരീക്ഷിക്കുന്നു, കൂടാതെ സിടി മൂല്യവും സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവും തമ്മിലുള്ള ബന്ധത്തിലൂടെ ആരംഭ ടെംപ്ലേറ്റിനെ അളവ്പരമായി വിശകലനം ചെയ്യുന്നു.

RT-PCR-യുടെ നിർദ്ദിഷ്ട ഡാറ്റഅടിസ്ഥാനരേഖ, ഫ്ലൂറസെൻസ് ത്രെഷോൾഡ്ഒപ്പംCt മൂല്യം.

RT-PCR-നുള്ള പൊതുവായ ലേബലിംഗ് രീതികൾ:

2. പരീക്ഷണ ഘട്ടങ്ങൾ

2.1 പരീക്ഷണ ഗ്രൂപ്പിംഗിനെക്കുറിച്ച്- ഗ്രൂപ്പിൽ ഒന്നിലധികം കിണറുകൾ ഉണ്ടായിരിക്കണം, ജൈവിക ആവർത്തനങ്ങൾ ഉണ്ടായിരിക്കണം.

2.2 പ്രൈമർ ഡിസൈനിന്റെ തത്വങ്ങൾ

①SiRNA സ്പീഷീസ്-നിർദ്ദിഷ്ടമാണ്, വ്യത്യസ്ത സ്പീഷീസുകളുടെ ക്രമങ്ങൾ വ്യത്യസ്തമായിരിക്കും.

②SiRNA ഫ്രീസ്-ഡ്രൈഡ് പൊടിയിൽ പാക്കേജുചെയ്തിരിക്കുന്നു, ഇത് ഊഷ്മാവിൽ 2-4 ആഴ്ച വരെ സ്ഥിരമായി സൂക്ഷിക്കാം.

2.3 ടൂളുകൾ അല്ലെങ്കിൽ റിയാഗന്റുകൾ മുൻകൂട്ടി തയ്യാറാക്കേണ്ടതുണ്ട്

2.4 നിർദ്ദിഷ്ട പരീക്ഷണ ഘട്ടങ്ങളിൽ ശ്രദ്ധിക്കേണ്ട പ്രശ്നങ്ങളെ സംബന്ധിച്ച്:

①siRNA കൈമാറ്റ പ്രക്രിയ

1. പ്ലേറ്റിംഗിനായി, നിങ്ങൾക്ക് 24-കിണർ പ്ലേറ്റ്, 12-കിണർ പ്ലേറ്റ് അല്ലെങ്കിൽ 6-കിണർ പ്ലേറ്റ് എന്നിവ തിരഞ്ഞെടുക്കാം (24-കിണർ പ്ലേറ്റിന്റെ ഓരോ കിണറിലും ശരാശരി RNA സാന്ദ്രത ഏകദേശം 100-300 ng/uL ആണ്), കൂടാതെ കോശങ്ങളുടെ ഒപ്റ്റിമൽ ട്രാൻസ്ഫെക്ഷൻ സാന്ദ്രത 60 %-80% വരെയാണ്.

2. കൈമാറ്റ ഘട്ടങ്ങളും നിർദ്ദിഷ്ട ആവശ്യകതകളും നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി കർശനമായി പാലിക്കുന്നു.

3. ട്രാൻസ്ഫെക്ഷന് ശേഷം, സാമ്പിളുകൾ 24-72 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ mRNA കണ്ടെത്തലിനായി (RT-PCR) അല്ലെങ്കിൽ പ്രോട്ടീൻ കണ്ടെത്തൽ 48-96 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ (WB) ശേഖരിക്കാം.

② RNA വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ പ്രക്രിയ

1. എക്സോജനസ് എൻസൈമുകൾ വഴി മലിനീകരണം തടയുക.അതിൽ പ്രധാനമായും മാസ്കുകളും കയ്യുറകളും കർശനമായി ധരിക്കുന്നത് ഉൾപ്പെടുന്നു;അണുവിമുക്തമാക്കിയ പൈപ്പറ്റ് ടിപ്പുകളും ഇപി ട്യൂബുകളും ഉപയോഗിച്ച്;പരീക്ഷണത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന വെള്ളം RNase-ഫ്രീ ആയിരിക്കണം.

2. ദ്രുത എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷൻ കിറ്റിൽ നിർദ്ദേശിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ രണ്ടുതവണ ചെയ്യാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു, ഇത് ശരിക്കും പരിശുദ്ധിയും വിളവും മെച്ചപ്പെടുത്തും.

3. മാലിന്യ ദ്രാവകം RNA കോളത്തിൽ സ്പർശിക്കരുത്.

③ RNA അളവ്

ആർഎൻഎ എക്‌സ്‌ട്രാക്‌റ്റുചെയ്‌തതിനുശേഷം, അതിനെ നാനോഡ്രോപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് നേരിട്ട് അളക്കാൻ കഴിയും, കൂടാതെ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ വായന 10ng/ul വരെയാകാം.

④ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രക്രിയ

1. RT-qPCR-ന്റെ ഉയർന്ന സെൻസിറ്റിവിറ്റി കാരണം, ഓരോ സാമ്പിളിനും കുറഞ്ഞത് 3 സമാന്തര കിണറുകളെങ്കിലും ഉണ്ടാക്കണം, തുടർന്നുള്ള Ct വളരെ വ്യത്യസ്തമാകുന്നത് തടയാൻ അല്ലെങ്കിൽ സ്ഥിതിവിവര വിശകലനത്തിന് SD വളരെ വലുതാകാതിരിക്കാൻ.

2. ഫ്രീസ് ചെയ്യരുത്, മാസ്റ്റർ മിക്സ് ആവർത്തിച്ച് ഉരുകുക.

3. ഓരോ ട്യൂബ്/ദ്വാരവും ഒരു പുതിയ ടിപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിക്കേണ്ടതാണ്!സാമ്പിളുകൾ ചേർക്കാൻ ഒരേ പൈപ്പറ്റ് ടിപ്പ് തുടർച്ചയായി ഉപയോഗിക്കരുത്!

4. സാമ്പിൾ ചേർത്തതിനുശേഷം 96-കിണർ പ്ലേറ്റിൽ ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ഫിലിം ഒരു പ്ലേറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് മിനുസപ്പെടുത്തേണ്ടതുണ്ട്.മെഷീനിൽ ഇടുന്നതിന് മുമ്പ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുന്നതാണ് നല്ലത്, അങ്ങനെ ട്യൂബ് ഭിത്തിയിലെ ദ്രാവകം താഴേക്ക് ഒഴുകുകയും വായു കുമിളകൾ നീക്കം ചെയ്യുകയും ചെയ്യും.

⑤കോമൺ കർവ് വിശകലനം

2.5 ഡാറ്റ വിശകലനത്തെക്കുറിച്ച്

qPCR ന്റെ ഡാറ്റ വിശകലനം ആപേക്ഷിക അളവ്, കേവല അളവ് എന്നിങ്ങനെ വിഭജിക്കാം.ഉദാഹരണത്തിന്, നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പിലെ സെല്ലുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ചികിത്സാ ഗ്രൂപ്പിലെ സെല്ലുകൾ,

X ജീനിന്റെ mRNA എത്ര തവണ മാറുന്നു, ഇത് ആപേക്ഷിക അളവാണ്;ഒരു നിശ്ചിത എണ്ണം കോശങ്ങളിൽ, X ജീനിന്റെ mRNA

എത്ര പകർപ്പുകൾ ഉണ്ട്, ഇത് കേവലമായ അളവാണ്.സാധാരണയായി ലബോറട്ടറിയിൽ നമ്മൾ ഏറ്റവും കൂടുതൽ ഉപയോഗിക്കുന്നത് ആപേക്ഷിക അളവ് രീതിയാണ്.സാധാരണയായി,2-ΔΔct രീതിപരീക്ഷണങ്ങളിൽ ഏറ്റവും കൂടുതൽ ഉപയോഗിക്കുന്നത്, അതിനാൽ ഈ രീതി മാത്രമേ ഇവിടെ വിശദമായി അവതരിപ്പിക്കുകയുള്ളൂ.

2-ΔΔct രീതി: കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പിലെ ടാർഗെറ്റ് ജീനുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ പരീക്ഷണ ഗ്രൂപ്പിലെ ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ പ്രകടനത്തിലെ വ്യത്യാസമാണ് ലഭിച്ച ഫലം.ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെയും ഇന്റേണൽ റഫറൻസ് ജീനിന്റെയും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത 100% ന് അടുത്തായിരിക്കണം, ആപേക്ഷിക വ്യതിയാനം 5% കവിയാൻ പാടില്ല.

കണക്കുകൂട്ടൽ രീതി ഇപ്രകാരമാണ്:

Δct കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പ് = കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പിലെ ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ സിടി മൂല്യം - കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പിലെ ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനിന്റെ സിടി മൂല്യം

Δct പരീക്ഷണാത്മക ഗ്രൂപ്പ് = പരീക്ഷണ ഗ്രൂപ്പിലെ ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ ct മൂല്യം - പരീക്ഷണ ഗ്രൂപ്പിലെ ആന്തരിക റഫറൻസ് ജീനിന്റെ ct മൂല്യം

ΔΔct=Δct പരീക്ഷണാത്മക ഗ്രൂപ്പ്-Δct നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പ്

അവസാനമായി, എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലിലെ വ്യത്യാസത്തിന്റെ ഗുണിതം കണക്കാക്കുക:

ഫോൾഡ്=2-ΔΔct മാറ്റുക (എക്‌സൽ ഫംഗ്‌ഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ടത് പവർ ആണ്)

ബന്ധപ്പെട്ട ഉല്പന്നങ്ങൾ:

സെൽ ഡയറക്ട് RT-qPCR കിറ്റ്