Ⅰ. പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിന്റെ സംവേദനക്ഷമത വർദ്ധിപ്പിക്കുക:

1. ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള RNA വേർതിരിക്കുക:

വിജയകരമായ cDNA സിന്തസിസ് ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള RNA-യിൽ നിന്നാണ്.ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള ആർ‌എൻ‌എ കുറഞ്ഞത് മൊത്തത്തിലുള്ള ദൈർഘ്യമെങ്കിലും ഉറപ്പാക്കണം കൂടാതെ EDTA അല്ലെങ്കിൽ SDS പോലുള്ള റെക്കോർഡിംഗ് എൻസൈമുകൾ അടങ്ങിയിട്ടില്ലാത്ത ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ അടങ്ങിയിട്ടില്ല.ആർഎൻഎയുടെ ഗുണനിലവാരം നിങ്ങൾക്ക് സിഡിഎൻഎയിലേക്ക് ട്രാൻസ്‌ക്രൈബ് ചെയ്യാൻ കഴിയുന്ന സീക്വൻസ് വിവരങ്ങളുടെ പരമാവധി മൂല്യം നിർണ്ണയിക്കുന്നു.ഐസോസയനേറ്റ്/അസിഡോഫെനോൾ ഉപയോഗിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു സ്റ്റെപ്പ് രീതിയാണ് പൊതു ആർഎൻഎ ശുദ്ധീകരണ രീതി.RNase-ന്റെ മലിനീകരണം തടയുന്നതിന്, RNase-ൽ (പാൻക്രിയാസ് പോലുള്ളവ) സമ്പന്നമായ ഒരു സാമ്പിളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത RNA-യ്ക്ക് ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള RNA സംരക്ഷിക്കാൻ ഫോർമാൽഡിഹൈഡിന്റെ സംഭരണം ആവശ്യമാണ്, ഇത് ദീർഘകാല സംഭരണത്തിന് ഇതിലും കൂടുതലാണ്.എലിയുടെ കരളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ആർ‌എൻ‌എ അടിസ്ഥാനപരമായി ഒരാഴ്ച വെള്ളത്തിൽ സംഭരിച്ചതിന് ശേഷം നശിപ്പിച്ചു, അതേസമയം എലി പ്ലീഹയിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ആർ‌എൻ‌എ മൂന്ന് വർഷത്തെ വെള്ളത്തിൽ സംഭരിച്ചതിന് ശേഷവും സ്ഥിരത നിലനിർത്തി.കൂടാതെ, ചെറിയ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളേക്കാൾ 4kb-ൽ കൂടുതലുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ RNase ഡീഗ്രേഡേഷൻ കണ്ടെത്തുന്നതിന് കൂടുതൽ സെൻസിറ്റീവ് ആണ്.സ്റ്റോറേജ് ആർഎൻഎ സാമ്പിളിന്റെ സ്ഥിരത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന്, ആർഎൻഎ അയോണിന്റെ മെതാൽമാമൈനിൽ ലയിപ്പിക്കാം, അത് -70 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സൂക്ഷിക്കുന്നു.ആർ‌എൻ‌എയെ സംരക്ഷിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന തൈലൈഡിൽ ആർ‌എൻ‌എയെ തരംതാഴ്ത്തുന്ന ഒരു വിവിധ വസ്തു അടങ്ങിയിരിക്കരുത്.പാൻക്രിയാസിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ആർ.എൻ.എ., കുറഞ്ഞത് ഒരു വർഷത്തേക്കെങ്കിലും മെതാൽമമൈനിൽ സൂക്ഷിക്കാൻ കഴിയും.നിങ്ങൾ ആർഎൻഎ ഉപയോഗിക്കാൻ തയ്യാറാകുമ്പോൾ, ആർഎൻഎയെ പ്രേരിപ്പിക്കാൻ നിങ്ങൾക്ക് ഇനിപ്പറയുന്ന രീതികൾ ഉപയോഗിക്കാം: NaCl 0.2 മീറ്ററിലേക്കും എത്തനോളിന്റെ 4 മടങ്ങ് വോളിയത്തിലേക്കും ചേർക്കുക, മുറിയിലെ താപനില 3-5 മിനിറ്റ്, 10,000 × ഗ്രാം സെന്റിഫ്യൂഗൽ 5 മിനിറ്റ്.

2. RNaseH ആക്റ്റിവിറ്റി (RNaseH-) ഇല്ലാതെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ഉപയോഗിക്കുക:

cDNA സിന്തസിസിന്റെ ദൈർഘ്യവും വിളവും വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനായി RNase ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ പലപ്പോഴും റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രതികരണങ്ങളിൽ ചേർക്കുന്നു.ബഫറുകളുടെയും ഡിടിടി പോലുള്ള ഏജന്റുമാരുടെയും സാന്നിധ്യത്തിൽ ആദ്യ ചെയിൻ സിന്തസിസ് പ്രതികരണത്തിൽ RNase ഇൻഹിബിറ്റർ ചേർക്കുന്നു, കാരണം പ്രീ-സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസ് പ്രക്രിയ ഇൻഹിബിറ്ററിനെ ഇല്ലാതാക്കുന്നു, അതുവഴി ആർഎൻഎയെ തരംതാഴ്ത്തുന്ന ബൗണ്ടഡ് ആർ‌എൻ‌എസുകൾ പുറത്തുവിടുന്നു.പ്രോട്ടീൻ RNase ഇൻഹിബിറ്റർ RNase A, B, C വഴി RNA യുടെ ഡീഗ്രേഡേഷൻ തടയുന്നു, ചർമ്മത്തിൽ RNases തടയരുത്, അതിനാൽ ഈ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ചിട്ടും വിരലുകളിൽ നിന്ന് RNases അവതരിപ്പിക്കാതിരിക്കാൻ ശ്രദ്ധിക്കണം.

റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ആർഎൻഎയെ സിഡിഎൻഎ ആക്കി മാറ്റുന്നത് ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു.M-MLV, AMV എന്നിവയ്‌ക്ക് സ്വന്തം പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനത്തിന് പുറമേ എൻഡോജെനസ് RNaseH പ്രവർത്തനവുമുണ്ട്.ആർഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്കും ഡിഎൻഎ പ്രൈമറുകൾക്കും സിഡിഎൻഎ എക്സ്റ്റൻഷൻ സ്‌ട്രാൻഡുകൾക്കുമിടയിൽ രൂപപ്പെടുന്ന ഹെറ്ററോസൈഗസ് സ്ട്രോണ്ടുകൾക്കായുള്ള പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനവുമായി RNaseH പ്രവർത്തനം മത്സരിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഡിഎൻഎ കോംപ്ലക്സുകളിലെ ആർഎൻഎ: ആർഎൻഎ സ്ട്രാൻഡുകളെ തരംതാഴ്ത്തുന്നു.RNaseH പ്രവർത്തനത്താൽ തരംതാഴ്ന്ന ആർഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റുകൾ സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസിന് ഫലപ്രദമായ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളായി ഉപയോഗിക്കാൻ കഴിയില്ല, ഇത് സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസിന്റെ വിളവും ദൈർഘ്യവും കുറയ്ക്കുന്നു.അങ്ങനെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിന്റെ RNaseH പ്രവർത്തനം ഇല്ലാതാക്കുകയോ വലിയ തോതിൽ കുറയ്ക്കുകയോ ചെയ്യുന്നത് വലിയ പ്രയോജനം ചെയ്യും.

സൂപ്പർസ്ക്രിപ്റ്റ്Ⅱ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്, RNaseH-ന്റെ MMLV റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്, തെർമോസ്ക്രിപ്റ്റ് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്, RNaseH-യുടെ AMV, MMLV, AMV എന്നിവയേക്കാൾ കൂടുതൽ ദൈർഘ്യമുള്ള cDNA നൽകി.ആർടി-പിസിആർ സംവേദനക്ഷമതയെ സിഡിഎൻഎ സമന്വയിപ്പിച്ച അളവ് ബാധിക്കുന്നു.തെർമോസ്ക്രിപ്റ്റ് എഎംവിയേക്കാൾ വളരെ സെൻസിറ്റീവ് ആണ്.RT-PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ വലിപ്പം cDNA സമന്വയിപ്പിക്കാനുള്ള റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിന്റെ കഴിവ് പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു, പ്രത്യേകിച്ച് വലിയ Cdnas ക്ലോണിംഗ് ചെയ്യുമ്പോൾ.MMLV-യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, SuperScripⅡ ദൈർഘ്യമേറിയ RT-PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ വിളവ് ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചു.RNaseH- ന്റെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസും താപ സ്ഥിരത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു, അതിനാൽ സാധാരണ 37-42℃ എന്നതിനേക്കാൾ ഉയർന്ന താപനിലയിൽ പ്രതികരണം നടത്താം.നിർദ്ദേശിക്കപ്പെട്ട സിന്തസിസ് വ്യവസ്ഥകളിൽ, ഒലിഗോ(dT) പ്രൈമറുകളും 10μCi [alpha-p]dCTP ഉം ഉപയോഗിച്ചു.ആദ്യ ശൃംഖലയുടെ മൊത്തം ഉൽപ്പാദനം TCA മഴയുടെ രീതി ഉപയോഗിച്ചാണ് കണക്കാക്കിയത്.വലിപ്പം ക്രമീകരിച്ച സ്ട്രിപ്പ് നീക്കം ചെയ്യലും ആൽക്കലൈൻ അഗറോസ് ജെല്ലിൽ എണ്ണലും ഉപയോഗിച്ച് പൂർണ്ണ ദൈർഘ്യമുള്ള cDNA വിശകലനം ചെയ്തു.

3. റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന്റെ താപ സംരക്ഷണ താപനില വർദ്ധിപ്പിക്കുക:

ഉയർന്ന ഹോൾഡിംഗ് താപനില ആർഎൻഎയുടെ ദ്വിതീയ ഘടന തുറക്കുന്നതിനും പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന്റെ വിളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും സഹായിക്കുന്നു.ഒട്ടുമിക്ക RNA ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്കും, ബഫറോ ഉപ്പോ ഇല്ലാതെ 65°C താപനിലയിൽ RNA, പ്രൈമർ എന്നിവ പിടിക്കുകയും പിന്നീട് ഐസിൽ പെട്ടെന്ന് തണുപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നത് മിക്ക ദ്വിതീയ ഘടനകളെയും ഇല്ലാതാക്കുകയും പ്രൈമറുകൾ ബന്ധിപ്പിക്കാൻ അനുവദിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, ചില ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്ക് തെർമൽ ഡിനാറ്ററേഷനു ശേഷവും ദ്വിതീയ ഘടനയുണ്ട്.ഈ ബുദ്ധിമുട്ടുള്ള ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ തെർമോസ്ക്രിപ്റ്റ് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ഉപയോഗിച്ചും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിന് ഉയർന്ന താപനിലയിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് പ്രതികരണം സ്ഥാപിക്കുന്നതിലൂടെയും നടത്താം.ഉയർന്ന ഹോൾഡിംഗ് താപനിലയും പ്രത്യേകത വർദ്ധിപ്പിക്കും, പ്രത്യേകിച്ചും ജീൻ-സ്പെസിഫിക് പ്രൈമറുകൾ (GSPS) ഉപയോഗിച്ച് cDNA സിന്തസിസ് നടത്തുമ്പോൾ (അധ്യായം 3 കാണുക).GSP ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ, പ്രൈമറിന്റെ Tm മൂല്യം പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന ഹോൾഡിംഗ് താപനിലയ്ക്ക് തുല്യമാണെന്ന് ഉറപ്പാക്കുക.60℃ ന് മുകളിലുള്ള ഒലിഗോ(dT), റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കരുത്.റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ 60 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലേക്ക് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് 25 ഡിഗ്രിയിൽ 10 മിനിറ്റ് പിടിക്കേണ്ടതുണ്ട്.ഉയർന്ന റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ താപനില ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് പുറമേ, 65℃ ഡിനാറ്ററിംഗ് താപനിലയിൽ നിന്ന് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഹോൾഡിംഗ് ടെമ്പറേച്ചറിലേക്ക് നേരിട്ട് ആർഎൻഎ/പ്രൈമർ മിശ്രിതം മാറ്റുകയും പ്രീഹീറ്റ് ചെയ്ത 2× റിയാക്ഷൻ മിശ്രിതം (സിഡിഎൻഎ തെർമൽ ഇനീഷ്യേഷൻ സിന്തസിസ്) ചേർക്കുകയും ചെയ്തുകൊണ്ട് പ്രത്യേകത മെച്ചപ്പെടുത്താം.താഴ്ന്ന ഊഷ്മാവിൽ സംഭവിക്കുന്ന ഇന്റർമോളികുലാർ ബേസ് ജോടിയാക്കൽ തടയാൻ ഈ സമീപനം സഹായിക്കുന്നു.ഒരു PCR ഉപകരണം ഉപയോഗിക്കുന്നത് RT-PCR-ന് ആവശ്യമായ നിരവധി താപനില സ്വിച്ചുകൾ ലളിതമാക്കുന്നു.

Tth ഹീറ്റ് സ്റ്റബിലൈസ്ഡ് പോളിമറേസ് Mg2+ ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ DNA പോളിമറേസും Mn2+ ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ RNA പോളിമറേസും ആയി പ്രവർത്തിക്കുന്നു.ഇതിന് 65 ഡിഗ്രി വരെ ചൂട് പിടിക്കാൻ കഴിയും.എന്നിരുന്നാലും, PCR സമയത്ത് Mn2+ ന്റെ സാന്നിധ്യം വിശ്വാസ്യത കുറയ്ക്കുന്നു, ഇത് cDNA ക്ലോണിംഗ് പോലുള്ള ഉയർന്ന കൃത്യതയുള്ള ആംപ്ലിഫിക്കേഷന് Tth പോളിമറേസിനെ അനുയോജ്യമാക്കുന്നില്ല.കൂടാതെ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനിൽ Tth കാര്യക്ഷമത കുറവാണ്, ഇത് സെൻസിറ്റിവിറ്റി കുറയ്ക്കുന്നു, കൂടാതെ ഒരൊറ്റ എൻസൈമിന് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും പിസിആറും ചെയ്യാൻ കഴിയുമെന്നതിനാൽ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും പിസിആറും നടത്താനാകുന്നതിനാൽ, മലിനമായ ജീനോമിക് ഡിഎൻഎയിൽ നിന്ന് സിഡിഎൻഎയുടെ ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നങ്ങളെ വേർതിരിച്ചറിയാൻ ഉപയോഗിക്കാനാവില്ല.

4. റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്ന അഡിറ്റീവ്:

ആദ്യ ചെയിൻ സിന്തസിസ് റിയാക്ഷനിൽ ഗ്ലിസറിൻ, ഡിഎംഎസ്ഒ എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള അഡിറ്റീവുകൾ ചേർക്കുന്നത് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡിന്റെ സ്ഥിരത കുറയ്ക്കുകയും ആർഎൻഎ ദ്വിതീയ ഘടനയെ അഴിച്ചുവിടുകയും ചെയ്യും.SuperScriptⅡ അല്ലെങ്കിൽ MMLV യുടെ പ്രവർത്തനത്തെ ബാധിക്കാതെ 20% ഗ്ലിസറിൻ അല്ലെങ്കിൽ 10% DMSO ചേർക്കാവുന്നതാണ്.എഎംവിക്ക് 20% ഗ്ലിസറോൾ വരെ പ്രവർത്തനം കുറയ്ക്കാതെ സഹിക്കാൻ കഴിയും.സൂപ്പർസ്ക്രിപ്റ്റ്Ⅱ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിയാക്ഷനിൽ RT-PCR-ന്റെ സംവേദനക്ഷമത പരമാവധി വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന്, 10% ഗ്ലിസറോൾ ചേർത്ത് 45℃-ൽ ഇൻസുലേറ്റ് ചെയ്യാം.പിസിആറിലേക്ക് റിട്രോട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ-റിയാക്ഷൻ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ 1/10 ചേർത്താൽ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രതികരണത്തിൽ ഗ്ലിസറോളിന്റെ സാന്ദ്രത 0.4% ആണ്, ഇത് പിസിആറിനെ തടയാൻ പര്യാപ്തമല്ല.

5. RNaseH പ്രോസസ്സിംഗ്:

PCR-ന് മുമ്പ് RNaseH ഉപയോഗിച്ച് cDNA സിന്തസിസ് പ്രതികരണങ്ങൾ ചികിത്സിക്കുന്നതിലൂടെ സംവേദനക്ഷമത മെച്ചപ്പെടുത്താം.ചില ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്ക്, സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസ് റിയാക്ഷനിലെ ആർഎൻഎ ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ബൈൻഡിംഗിനെ തടയുന്നു, ഈ സാഹചര്യത്തിൽ RNaseH ചികിത്സയ്ക്ക് സെൻസിറ്റിവിറ്റി വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.സാധാരണയായി, താരതമ്യേന നീളമുള്ള മുഴുനീള cDNA ടാർഗെറ്റ് ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി RNaseH ചികിത്സ ആവശ്യമാണ്, ട്യൂബറസ് സ്കെറോസിസ്Ⅱ പോലെ.ഈ ബുദ്ധിമുട്ടുള്ള ടെംപ്ലേറ്റിനായി, സൂപ്പർസ്ക്രിപ്റ്റ്Ⅱ അല്ലെങ്കിൽ AMV സമന്വയിപ്പിച്ച cDNA സൃഷ്ടിച്ച സിഗ്നൽ RNaseH മെച്ചപ്പെടുത്തി.മിക്ക RT-PCR പ്രതികരണങ്ങൾക്കും, RNaseH ചികിത്സ ഓപ്ഷണൽ ആണ്, കാരണം 95℃ ഇൻസുലേറ്റഡ് PCR ഡീനാറ്ററേഷൻ ഘട്ടം RNA: DNA സമുച്ചയത്തിൽ നിന്ന് RNA-യെ ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യുന്നു.

6. ചെറിയ അളവിൽ ആർഎൻഎ കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള മെച്ചപ്പെട്ട രീതികൾ:

ആർ‌എൻ‌എയുടെ ചെറിയ അളവിൽ മാത്രം ലഭ്യമാകുമ്പോൾ ആർ‌ടി-പി‌സി‌ആർ പ്രത്യേകിച്ചും വെല്ലുവിളി നിറഞ്ഞതാണ്.ആർഎൻഎ വേർതിരിക്കുമ്പോൾ ഗ്ലൈക്കോജൻ ഒരു വാഹകമായി ചേർക്കുന്നത് ചെറിയ സാമ്പിളുകളുടെ വിളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ സഹായിക്കുന്നു.ട്രൈസോളിന്റെ അതേ സമയം RNase-രഹിത ഗ്ലൈക്കോജൻ ചേർക്കാവുന്നതാണ്.ഗ്ലൈക്കോജൻ വെള്ളത്തിൽ ലയിക്കുന്നതാണ്, തുടർന്നുള്ള മഴയെ സഹായിക്കാൻ ആർഎൻഎയ്‌ക്കൊപ്പം ജലഘട്ടത്തിൽ തുടരാനാകും.50 മില്ലിഗ്രാമിൽ താഴെയുള്ള ടിഷ്യൂ അല്ലെങ്കിൽ 106 കൾച്ചർഡ് സെല്ലുകൾക്ക് RNase-ഫ്രീ ഗ്ലൈക്കോജന്റെ ശുപാർശിത സാന്ദ്രത 250μg/ml ആണ്.

സൂപ്പർസ്ക്രിപ്റ്റ്Ⅱ ഉപയോഗിച്ച് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിയാക്ഷനുകളിലേക്ക് അസറ്റിലേറ്റഡ് ബിഎസ്എ ചേർക്കുന്നത് സംവേദനക്ഷമത വർദ്ധിപ്പിക്കും, കൂടാതെ ചെറിയ അളവിലുള്ള ആർഎൻഎയ്ക്ക് സൂപ്പർസ്ക്രിപ്റ്റിന്റെ അളവ് കുറയ്ക്കുകയും RnaseOut ന്യൂക്ലീസ് ഇൻഹിബിറ്ററിന്റെ 40 യൂണിറ്റ് ചേർക്കുകയും ചെയ്യുന്നത് കണ്ടെത്തൽ നില മെച്ചപ്പെടുത്തും.ആർഎൻഎ വേർതിരിക്കലിൽ ഗ്ലൈക്കോജൻ ഉപയോഗിക്കുന്നുണ്ടെങ്കിൽ, സൂപ്പർസ്ക്രിപ്റ്റ്Ⅱ ഉപയോഗിച്ച് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിയാക്ഷനിലേക്ക് BSA അല്ലെങ്കിൽ RNase ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ചേർക്കുന്നത് ഇപ്പോഴും ശുപാർശ ചെയ്യപ്പെടുന്നു.

Ⅱ. RT-PCR ന്റെ പ്രത്യേകത വർദ്ധിപ്പിക്കുക

1. cNDA സിന്തസിസ്:

ആദ്യത്തെ സ്ട്രാൻഡ് സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസ് ആരംഭിക്കുന്നതിന് മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത രീതികൾ ഉപയോഗിക്കാം, കൂടാതെ ഓരോ രീതിയുടെയും ആപേക്ഷിക പ്രത്യേകത സിഡിഎൻഎയുടെ അളവിനെയും തരത്തെയും ബാധിക്കുന്നു.

റാൻഡം പ്രൈമർ രീതിയാണ് മൂന്ന് രീതികളിൽ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞത്.ഹ്രസ്വവും ഭാഗികവുമായ ദൈർഘ്യമുള്ള സിഡിഎൻഎ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിനായി ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റിലുടനീളം ഒന്നിലധികം സൈറ്റുകളിൽ പ്രൈമറുകൾ അനീൽ ചെയ്യുന്നു.ഈ രീതി പലപ്പോഴും 5′ ടെർമിനൽ സീക്വൻസുകളും സിഡിഎൻഎയും ദ്വിതീയ ഘടനാപരമായ പ്രദേശങ്ങളുള്ള ആർഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റുകളിൽ നിന്നോ അല്ലെങ്കിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിന് ആവർത്തിക്കാൻ കഴിയാത്ത ടെർമിനേറ്റിംഗ് സൈറ്റുകളിൽ നിന്നോ ലഭിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഏറ്റവും ദൈർഘ്യമേറിയ സിഡിഎൻഎ ലഭിക്കുന്നതിന്, ഓരോ ആർഎൻഎ സാമ്പിളിലെയും പ്രൈമറുകളുടെയും ആർഎൻഎയുടെയും അനുപാതം അനുഭവപരമായി നിർണ്ണയിക്കേണ്ടതുണ്ട്.റാൻഡം പ്രൈമറുകളുടെ പ്രാരംഭ സാന്ദ്രത 20μl പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിൽ 50 മുതൽ 250ng വരെയാണ്.റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് മൊത്തം ആർഎൻഎയിൽ നിന്ന് സിഡിഎൻഎ സമന്വയിപ്പിച്ചത് പ്രധാനമായും റൈബോസോമൽ ആർഎൻഎ ആയതിനാൽ, പോളി(എ)+ആർഎൻഎ പൊതുവെ ടെംപ്ലേറ്റായി തിരഞ്ഞെടുക്കപ്പെടുന്നു.

റാൻഡം പ്രൈമറുകളേക്കാൾ ഒലിഗോ(ഡിടി) ഇനീഷ്യേഷൻ കൂടുതൽ വ്യക്തമാണ്.മിക്ക യൂക്കറിയോട്ടിക് സെല്ലുകളിലും എംആർഎൻഎയുടെ 3′ അറ്റത്ത് കാണപ്പെടുന്ന പോളി(എ) വാൽ ഉപയോഗിച്ച് ഇത് സങ്കരീകരിക്കുന്നു.പോളി(എ)+ആർഎൻഎ മൊത്തം ആർഎൻഎയുടെ ഏകദേശം 1% മുതൽ 2% വരെ ആയതിനാൽ, cDNA യുടെ അളവും സങ്കീർണ്ണതയും റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നതിനേക്കാൾ വളരെ കുറവാണ്.ഉയർന്ന പ്രത്യേകത കാരണം, ഒലിഗോ(dT) ന് പൊതുവെ RNA മുതൽ പ്രൈമർ റേഷ്യോയ്ക്കും പോളി(A)+ സെലക്ഷനും ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ ആവശ്യമില്ല.20μl പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിൽ 0.5μg ഒലിഗോ (dT) ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.ഒലിഗോ(dT)12-18 മിക്ക RT-PCR-നും അനുയോജ്യമാണ്.തെർമോസ്ക്രിപ്റ്റ് RT-PCR സിസ്റ്റം അതിന്റെ നല്ല താപ സ്ഥിരത കാരണം ഒലിഗോ(dT)20 നൽകുന്നു, ഉയർന്ന ഹോൾഡിംഗ് താപനിലയ്ക്ക് അനുയോജ്യമാണ്.

ജീൻ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ (GSP) റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സ്റ്റെപ്പിനുള്ള മികച്ച നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകളാണ്.റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ഒലിഗോ(dT) പോലെയുള്ള എല്ലാ Rna-കളെയും അനിയൽ ചെയ്യുന്നതിനുപകരം, RNA ഡെസ്റ്റിനേഷൻ സീക്വൻസുകളുമായി പ്രത്യേകമായി ഹൈബ്രിഡൈസ് ചെയ്യാൻ കഴിയുന്ന ഒരു ആന്റിസെൻസ് ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോസൈഡാണ് GSP.പിസിആർ പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന നിയമങ്ങൾ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിയാക്ഷൻ ജിഎസ്പിയുടെ രൂപകൽപ്പനയ്ക്കും ബാധകമാണ്.mRNA3′ ന്റെ അവസാനം അനീൽ ചെയ്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രൈമറിന്റെ അതേ ക്രമം GSP ആകാം, അല്ലെങ്കിൽ റിവേഴ്സ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രൈമർ ഉപയോഗിച്ച് താഴേയ്ക്ക് അനീൽ ചെയ്യാൻ GSP രൂപകൽപ്പന ചെയ്യാം.ചില ആംപ്ലിഫൈഡ് ഒബ്‌ജക്റ്റുകൾക്ക്, വിജയകരമായ RT-PCR-നായി ഒന്നിലധികം ആന്റിസെൻസ് പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്, കാരണം ടാർഗെറ്റ് ആർഎൻഎയുടെ ദ്വിതീയ ഘടന പ്രൈമറിനെ ബൈൻഡിംഗിൽ നിന്ന് തടഞ്ഞേക്കാം.20μl ന്റെ ആദ്യ ചെയിൻ സിന്തസിസ് റിയാക്ഷൻ സിസ്റ്റത്തിൽ 1pmol ആന്റിസെൻസ് GSP ഉപയോഗിക്കാൻ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു.

2. റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന്റെ താപ സംരക്ഷണ താപനില വർദ്ധിപ്പിക്കുക:

GSP സ്പെസിഫിറ്റിയുടെ പൂർണ പ്രയോജനം ലഭിക്കുന്നതിന്, ഉയർന്ന താപ സ്ഥിരതയുള്ള റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ഉപയോഗിക്കണം.പ്രതികരണ കാഠിന്യം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് ചൂട്-സ്ഥിരതയുള്ള റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ഉയർന്ന താപനിലയിൽ ഇൻസുലേറ്റ് ചെയ്യാവുന്നതാണ്.ഉദാഹരണത്തിന്, ഒരു ജിഎസ്പി 55 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ അനീൽ ചെയ്താൽ, എഎംവി അല്ലെങ്കിൽ എം-എംഎൽവി ഉപയോഗിച്ച് കുറഞ്ഞ കാഠിന്യത്തോടെ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ നടത്തുകയാണെങ്കിൽ, ജിഎസ്പിയുടെ പ്രത്യേകത പൂർണമായി ഉപയോഗിക്കപ്പെടില്ല.എന്നിരുന്നാലും, SuperScripⅡ-നും ThermoScript-നും 50℃ അല്ലെങ്കിൽ അതിലും ഉയർന്ന താപനിലയിൽ പ്രതികരിക്കാൻ കഴിയും, ഇത് കുറഞ്ഞ താപനിലയിൽ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്ന നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളെ ഇല്ലാതാക്കുന്നു.പരമാവധി സ്പെസിഫിറ്റിക്കായി, ആർഎൻഎ/പ്രൈമർ മിശ്രിതം 65℃ ഡിനാറ്ററേഷൻ താപനിലയിൽ നിന്ന് നേരിട്ട് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഹോൾഡിംഗ് ടെമ്പറേച്ചറിലേക്ക് ഒരു പ്രീഹീറ്റ് ചെയ്ത 2 x റിയാക്ഷൻ മിശ്രിതം (സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസിന്റെ തെർമൽ ഇനീഷ്യേഷൻ) ചേർത്ത് മാറ്റാം.താഴ്ന്ന ഊഷ്മാവിൽ തന്മാത്രകൾ തമ്മിലുള്ള അടിസ്ഥാന ജോടിയാക്കൽ തടയാൻ ഇത് സഹായിക്കുന്നു.ഒരു PCR ഉപകരണം ഉപയോഗിക്കുന്നത് RT-PCR-ന് ആവശ്യമായ നിരവധി താപനില സംക്രമണങ്ങളെ ലളിതമാക്കുന്നു.

3. ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ മലിനീകരണം കുറയ്ക്കുക

ആർ‌ടി-പി‌സി‌ആറിന്റെ സാധ്യതയുള്ള ഒരു ബുദ്ധിമുട്ട് ആർ‌എൻ‌എ ജനിതക ഡിഎൻ‌എയെ മലിനമാക്കുന്നു എന്നതാണ്.ട്രൈസോൾ റീജന്റ് പോലെയുള്ള മികച്ച ആർഎൻഎ വേർതിരിക്കൽ രീതികളുടെ ഉപയോഗം ആർഎൻഎ തയ്യാറെടുപ്പുകളിൽ ജനിതക ഡിഎൻഎ മലിനീകരണം കുറയ്ക്കുന്നു.ജീനോമിക് ഡിഎൻഎയിൽ നിന്ന് ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്ന ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ഒഴിവാക്കുന്നതിന്, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ചെയ്യുന്നതിന് മുമ്പ് മലിനമായ ഡിഎൻഎ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി ആർഎൻഎയെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഗ്രേഡ് DnasⅠ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കാം.DNaseⅠ ദഹനം അവസാനിപ്പിക്കാൻ സാമ്പിളുകൾ 10 മിനിറ്റ് 2.0mM EDTA-യിൽ 65℃-ൽ സൂക്ഷിച്ചു.ഉയർന്ന ഊഷ്മാവിൽ സംഭവിക്കുന്ന മഗ്നീഷ്യം അയോണിനെ ആശ്രയിച്ചുള്ള ആർഎൻഎ ജലവിശ്ലേഷണത്തെ തടയാൻ EDTA മഗ്നീഷ്യം അയോണുകളെ ചെലേറ്റ് ചെയ്യുന്നു.

ജീനോം ഡിഎൻഎ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നത്തിൽ നിന്ന് ആംപ്ലിഫൈഡ് സിഡിഎൻഎ വേർതിരിക്കുന്നതിന്, വേർതിരിച്ച എക്സോണിനൊപ്പം വെവ്വേറെ അനിയൽ ചെയ്യുന്ന പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യാൻ കഴിയും.സിഡിഎൻഎയിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ മലിനമായ ജീനോമിക് ഡിഎൻഎയിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞതിനേക്കാൾ ചെറുതായിരിക്കും.ഓരോ ആർഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റിലും റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഇല്ലാതെ നിയന്ത്രിത പരീക്ഷണം നടത്തുന്നു, നൽകിയ ശകലം ജനിതക ഡിഎൻഎയിൽ നിന്നാണോ സിഡിഎൻഎയിൽ നിന്നാണോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ.റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന്റെ അഭാവത്തിൽ ലഭിച്ച പിസിആർ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ജനിതകത്തിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞതാണ്.

അനുബന്ധ ഉൽപ്പന്നം

RT-PCR എളുപ്പമാണ്^ᵀᴹഞാൻ (ഒരു പടി)

ഒരേ ട്യൂബിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും പിസിആറും നടത്താൻ ഒറ്റ-ഘട്ട കിറ്റ് സഹായിക്കുന്നു.ഇതിന് ടെംപ്ലേറ്റ് RNA, നിർദ്ദിഷ്ട PCR പ്രൈമറുകൾ, RNase-Free ddH എന്നിവ മാത്രമേ ചേർക്കേണ്ടതുള്ളൂ₂O.

-ആർഎൻഎയുടെ തത്സമയ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് വിശകലനം വേഗത്തിലും കൃത്യമായും നടത്താം.

പ്രതികരണത്തിന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയും പ്രത്യേകതയും ഫലപ്രദമായി മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനായി കിറ്റ് ഒരു അദ്വിതീയ ഫോർജീൻ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിയാജന്റും ഫോർജീൻ ഹോട്ട്സ്റ്റാർ ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസും ഒരു അദ്വിതീയ പ്രതികരണ സംവിധാനവും ഉപയോഗിക്കുന്നു.

ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത പ്രതികരണ സംവിധാനം പ്രതികരണത്തിന് ഉയർന്ന ഡിറ്റക്ഷൻ സെൻസിറ്റിവിറ്റി, ശക്തമായ താപ സ്ഥിരത, മികച്ച സഹിഷ്ണുത എന്നിവ ഉണ്ടാക്കുന്നു.

RT Easy II (GDNase-നൊപ്പം) GDNase-നൊപ്പം തത്സമയ PCR-നുള്ള ഫസ്റ്റ്-സ്ട്രാൻഡ് CDNA സിന്തസിസിനായുള്ള മാസ്റ്റർ പ്രീമിക്സ്

-2 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ടെംപ്ലേറ്റിലെ gDNA നീക്കം ചെയ്യാൻ കഴിയുന്ന gDNA നീക്കം ചെയ്യാനുള്ള കാര്യക്ഷമമായ കഴിവ്.

- കാര്യക്ഷമമായ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സിസ്റ്റം, ആദ്യ സ്ട്രാൻഡ് cDNA യുടെ സമന്വയം പൂർത്തിയാക്കാൻ 15 മിനിറ്റ് മാത്രമേ എടുക്കൂ.

-സങ്കീർണ്ണമായ ടെംപ്ലേറ്റുകൾ: ഉയർന്ന ജിസി ഉള്ളടക്കവും സങ്കീർണ്ണമായ ദ്വിതീയ ഘടനയും ഉള്ള ടെംപ്ലേറ്റുകളും ഉയർന്ന കാര്യക്ഷമതയോടെ വിപരീതമാക്കാവുന്നതാണ്.

ഹൈ-സെൻസിറ്റിവിറ്റി റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സിസ്റ്റം, pg-ലെവൽ ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്കും ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള cDNA ലഭിക്കും.

റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സിസ്റ്റത്തിന് ഉയർന്ന താപ സ്ഥിരതയുണ്ട്, ഒപ്റ്റിമൽ റിയാക്ഷൻ താപനില 42℃ ആണ്, കൂടാതെ ഇതിന് ഇപ്പോഴും 50℃-ൽ മികച്ച റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രകടനമുണ്ട്.