ലബോറട്ടറിയിൽ പുതിയതായി, കുറഞ്ഞ പരിവർത്തന നിരക്ക് ഉള്ള ഒരു കൂട്ടം ചെടികളിൽ നിന്ന് പോസിറ്റീവ് സസ്യങ്ങൾ പരിശോധിക്കുന്നത് നല്ല ജോലിയല്ല.ഒന്നാമതായി, ധാരാളം സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് ഡിഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കണം, തുടർന്ന് വിദേശ ജീനുകൾ പിസിആർ കണ്ടെത്തും.എന്നിരുന്നാലും, ഫലങ്ങൾ പലപ്പോഴും ശൂന്യവും ബാൻഡുകളുമാണ്, ഇടയ്ക്കിടെ കുറച്ച് ഇനങ്ങൾ അടങ്ങിയിട്ടുണ്ട്, എന്നാൽ മിസ്ഡ് ഡിറ്റക്ഷനുകളോ തെറ്റായ കണ്ടെത്തലുകളോ ഉണ്ടോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ കഴിയില്ല..അത്തരം പരീക്ഷണ പ്രക്രിയകളെയും ഫലങ്ങളെയും അഭിമുഖീകരിക്കുന്നത് വളരെ നിസ്സഹായമാണോ?വിഷമിക്കേണ്ട, ട്രാൻസ്ജെനിക് പോസിറ്റീവ് സസ്യങ്ങളെ എങ്ങനെ എളുപ്പത്തിലും കൃത്യമായും പരിശോധിക്കാമെന്ന് സഹോദരൻ നിങ്ങളെ പഠിപ്പിക്കുന്നു.

ഘട്ടം 1

ഡിസൈൻ ഡിറ്റക്ഷൻ പ്രൈമറുകൾ

പരിശോധിക്കേണ്ട സാമ്പിൾ അനുസരിച്ച് കണ്ടെത്തേണ്ട എൻഡോജെനസ് ജീനും എക്സോജനസ് ജീനും നിർണ്ണയിക്കുക, പ്രൈമർ ഡിസൈനിനായി ജീനിൽ ഒരു പ്രതിനിധി 100-500 ബിപി സീക്വൻസ് തിരഞ്ഞെടുക്കുക.നല്ല പ്രൈമറുകൾക്ക് കണ്ടെത്തൽ ഫലങ്ങളുടെ കൃത്യത ഉറപ്പാക്കാനും കണ്ടെത്തൽ സമയം കുറയ്ക്കാനും കഴിയും (സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ഡിറ്റക്ഷൻ പ്രൈമറുകൾക്കുള്ള അനുബന്ധം കാണുക).

അറിയിപ്പ്: പുതുതായി രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത പ്രൈമറുകൾ പ്രതികരണ സാഹചര്യങ്ങൾ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുകയും വലിയ തോതിലുള്ള കണ്ടെത്തലിന് മുമ്പ് കണ്ടെത്തലിന്റെ കൃത്യത, കൃത്യത, കണ്ടെത്തൽ പരിധി എന്നിവ സ്ഥിരീകരിക്കുകയും വേണം.

ഘട്ടം 2

പരീക്ഷണാത്മക പ്രോട്ടോക്കോൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുക

പോസിറ്റീവ് നിയന്ത്രണം: PCR പ്രതികരണ സംവിധാനവും അവസ്ഥകളും സാധാരണമാണോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ടാർഗെറ്റ് ശകലം അടങ്ങിയ ശുദ്ധീകരിച്ച DNA ഉപയോഗിക്കുക.

നെഗറ്റീവ്/ബ്ലാങ്ക് കൺട്രോൾ: PCR സിസ്റ്റത്തിൽ മലിനീകരണത്തിന്റെ ഉറവിടം ഉണ്ടോ എന്ന് കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ടാർഗെറ്റ് ശകലം അടങ്ങാത്ത DNA ടെംപ്ലേറ്റ് അല്ലെങ്കിൽ ddH2O ഉപയോഗിക്കുക.

ആന്തരിക റഫറൻസ് നിയന്ത്രണം: PCR-ന് ടെംപ്ലേറ്റ് കണ്ടുപിടിക്കാൻ കഴിയുമോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ സാമ്പിളിന്റെ എൻഡോജെനസ് ജീനിന്റെ പ്രൈമർ/പ്രോബ് കോമ്പിനേഷൻ ഉപയോഗിക്കുക.

അറിയിപ്പ്:

പരീക്ഷണ ഫലങ്ങളുടെ സാധുത വിലയിരുത്തുന്നതിന് ഓരോ ടെസ്റ്റിനും പോസിറ്റീവ്, നെഗറ്റീവ്/ശൂന്യമായ നിയന്ത്രണങ്ങളും ആന്തരിക നിയന്ത്രണ നിയന്ത്രണങ്ങളും സജ്ജീകരിക്കണം.

പരീക്ഷണ തയ്യാറെടുപ്പ്

ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ്, പരിഹാരം തുല്യമായി കലർന്നിട്ടുണ്ടോ എന്ന് നിരീക്ഷിക്കുക.മഴ കണ്ടെത്തിയാൽ, ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് അത് പിരിച്ചുവിടുകയും മിശ്രിതമാക്കുകയും വേണം.അസമമായ അയോൺ ഡിസ്ട്രിബ്യൂഷൻ ഒഴിവാക്കാൻ 2×PCR മിശ്രിതം പൈപ്പ് ചെയ്ത് മൈക്രോപിപ്പെറ്റുമായി ആവർത്തിച്ച് മിക്സ് ചെയ്യേണ്ടതുണ്ട്.

അറിയിപ്പ്:

മാനുവൽ പുറത്തെടുത്ത് ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം വായിക്കുക, മാനുവലിന്റെ ആവശ്യകതകൾക്ക് അനുസൃതമായി പരീക്ഷണത്തിന് മുമ്പ് തയ്യാറെടുപ്പുകൾ നടത്തുക.

ഘട്ടം 4

PCR പ്രതികരണ സംവിധാനം തയ്യാറാക്കുക

പരീക്ഷണാത്മക പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച്, പ്രൈമറുകൾ, H2O, 2×PCR എന്നിവ തുല്യമായി മിക്സ് ചെയ്യുക, സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്ത് ഓരോ പ്രതികരണ ട്യൂബിലേക്കും വിതരണം ചെയ്യുക.

അറിയിപ്പ്:

വലിയ തോതിലുള്ളതോ ദീർഘകാലമോ ആയ പരിശോധനകൾക്കായി, യുഎൻജി എൻസൈം അടങ്ങിയ പിസിആർ പ്രതികരണ സംവിധാനം ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു, ഇത് പിസിആർ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ മൂലമുണ്ടാകുന്ന എയറോസോൾ മലിനീകരണം ഫലപ്രദമായി ഒഴിവാക്കും.

ഘട്ടം 5

പ്രതികരണ ടെംപ്ലേറ്റ് ചേർക്കുക

ഡയറക്ട് പിസിആർ സാങ്കേതികവിദ്യ ഉപയോഗിച്ച്, മടുപ്പിക്കുന്ന ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ശുദ്ധീകരണ പ്രക്രിയയുടെ ആവശ്യമില്ല, സാമ്പിൾ ടെംപ്ലേറ്റ് 10 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ തയ്യാറാക്കാം, കൂടാതെ അനുബന്ധ പിസിആർ പ്രതികരണ സംവിധാനം ചേർക്കാനും കഴിയും.

അറിയിപ്പ്:

പിളർപ്പ് രീതിക്ക് മികച്ച കണ്ടെത്തൽ ഫലമുണ്ട്, കൂടാതെ ലഭിച്ച ഉൽപ്പന്നം ഒന്നിലധികം കണ്ടെത്തൽ പ്രതികരണങ്ങൾക്കായി ഉപയോഗിക്കാം.

5.1: ഇലകളുടെ നേരിട്ടുള്ള വികാസം

മാനുവലിലെ ചിത്രത്തിന്റെ വലുപ്പമനുസരിച്ച്, 2-3 മില്ലിമീറ്റർ വ്യാസമുള്ള ഇല ടിഷ്യു മുറിച്ച് പിസിആർ പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിൽ സ്ഥാപിക്കുക.

കുറിപ്പ്: ഇലക്കഷ്ണങ്ങൾ പിസിആർ പ്രതികരണ ലായനിയിൽ പൂർണ്ണമായും മുക്കിയെന്ന് ഉറപ്പാക്കുക, കൂടാതെ അമിതമായ ഇല ടിഷ്യു ചേർക്കരുത്.

5.2: ഇല പിളർപ്പ് രീതി

5-7 മില്ലിമീറ്റർ വ്യാസമുള്ള ഇല ടിഷ്യു മുറിച്ച് ഒരു സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിൽ വയ്ക്കുക.നിങ്ങൾ മുതിർന്ന ഇലകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുകയാണെങ്കിൽ, ഇലയുടെ പ്രധാന സിരയുടെ ടിഷ്യുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നത് ഒഴിവാക്കുക.Pipette 50ul Buffer P1 lysate ഒരു സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിലേക്ക് ലൈസെറ്റിന് ഇല കോശങ്ങളെ പൂർണ്ണമായും മുക്കി ഒരു തെർമൽ സൈക്ലറിലോ മെറ്റൽ ബാത്തിലോ വയ്ക്കുകയും 95 ° C താപനിലയിൽ 5-10 മിനിറ്റ് നേരം ലൈസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യാം.

50ul ബഫർ P2 ന്യൂട്രലൈസേഷൻ ലായനി ചേർത്ത് നന്നായി ഇളക്കുക.തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ലൈസേറ്റ് ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കാനും പിസിആർ പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിലേക്ക് ചേർക്കാനും കഴിയും.

കുറിപ്പ്: ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ അളവ് PCR സിസ്റ്റത്തിന്റെ 5-10% നും ഇടയിലാണ്, അത് 20% കവിയാൻ പാടില്ല (ഉദാഹരണത്തിന്, 20μl PCR സിസ്റ്റത്തിൽ, 1-2μl ലിസിസ് ലായനി ചേർക്കുക, 4μl-ൽ കൂടരുത്).

ഘട്ടം 6

പിസിആർ പ്രതികരണം

PCR റിയാക്ഷൻ ട്യൂബ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്ത ശേഷം, അത് ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി ഒരു PCR ഉപകരണത്തിൽ സ്ഥാപിക്കുന്നു.

അറിയിപ്പ്:

ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി പ്രതികരണം ശുദ്ധീകരിക്കാത്ത ടെംപ്ലേറ്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നു, അതിനാൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം ശുദ്ധീകരിച്ച DNA ടെംപ്ലേറ്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നതിനേക്കാൾ 5-10 സൈക്കിളുകൾ കൂടുതലാണ്.

ഘട്ടം 7

ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് കണ്ടെത്തലും ഫല വിശകലനവും

എം: 100ബിപി ഡിഎൻഎ ഗോവണി

1\4: ശുദ്ധീകരിച്ച DNA രീതി

2\5: നേരിട്ടുള്ള PCR രീതി

3\6: ശൂന്യമായ നിയന്ത്രണം

QC:

പരീക്ഷണത്തിൽ സജ്ജമാക്കിയിരിക്കുന്ന വിവിധ നിയന്ത്രണങ്ങളുടെ പരിശോധനാ ഫലങ്ങൾ ഇനിപ്പറയുന്ന വ്യവസ്ഥകൾ പാലിക്കണം.അല്ലെങ്കിൽ, പ്രശ്നത്തിന്റെ കാരണം വിശകലനം ചെയ്യണം, പ്രശ്നം ഇല്ലാതാക്കിയ ശേഷം വീണ്ടും പരിശോധന നടത്തണം.

പട്ടിക 1. വിവിധ നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പുകളുടെ സാധാരണ പരിശോധന ഫലങ്ങൾ

*പ്ലാസ്മിഡ് പോസിറ്റീവ് കൺട്രോളായി ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, എൻഡോജെനസ് ജീൻ ടെസ്റ്റ് ഫലം നെഗറ്റീവ് ആകാം

ഫല വിധി:

എ. സാമ്പിളിന്റെ എൻഡോജെനസ് ജീനിന്റെ പരിശോധനാഫലം നെഗറ്റീവ് ആണ്, ഇത് സാമ്പിളിൽ നിന്ന് സാധാരണ പിസിആർ കണ്ടെത്തലിന് അനുയോജ്യമായ ഡിഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ കഴിയില്ലെന്നോ വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഡിഎൻഎയിൽ പിസിആർ റിയാക്ഷൻ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെന്നോ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ഡിഎൻഎ വീണ്ടും വേർതിരിച്ചെടുക്കണം.

ബി. സാമ്പിളിന്റെ എൻഡോജെനസ് ജീനിന്റെ പരിശോധനാ ഫലം പോസിറ്റീവ് ആണ്, കൂടാതെ എക്സോജനസ് ജീനിന്റെ പരിശോധനാ ഫലം നെഗറ്റീവ് ആണ്, ഇത് സാമ്പിളിൽ നിന്ന് സാധാരണ പിസിആർ കണ്ടെത്തലിന് അനുയോജ്യമായ ഡിഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുത്തതായി സൂചിപ്പിക്കുന്നു, കൂടാതെ സാമ്പിളിൽ XXX ജീൻ കണ്ടെത്തിയിട്ടില്ലെന്ന് വിലയിരുത്താം.

സി. സാമ്പിളിന്റെ എൻഡോജെനസ് ജീനിന്റെ പരിശോധനാ ഫലം പോസിറ്റീവ് ആണ്, കൂടാതെ എക്സോജനസ് ജീനിന്റെ പരിശോധനാ ഫലം പോസിറ്റീവ് ആണ്, ഇത് സാമ്പിളിൽ നിന്ന് സാധാരണ പിസിആർ കണ്ടെത്തലിന് അനുയോജ്യമായ ഡിഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ടെന്നും സാമ്പിൾ ഡിഎൻഎയിൽ XXX ജീൻ അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെന്നും സൂചിപ്പിക്കുന്നു.സ്ഥിരീകരണ പരീക്ഷണങ്ങൾ കൂടുതൽ നടത്താം.

ഘട്ടം 8

ഡിസൈൻ ഡിറ്റക്ഷൻ പ്രൈമറുകൾ

പരീക്ഷണത്തിനു ശേഷം, 2% സോഡിയം ഹൈപ്പോക്ലോറൈറ്റ് ലായനിയും 70% എത്തനോൾ ലായനിയും ഉപയോഗിച്ച് പരിസ്ഥിതി മലിനീകരണം തടയാൻ പരീക്ഷണ പ്രദേശം തുടയ്ക്കുക.