RT-qPCR പരീക്ഷണത്തിൽ RNA എക്‌സ്‌ട്രാക്‌ഷനും ഗുണനിലവാര വിലയിരുത്തലും ഉൾപ്പെടുന്നു, റിവേഴ്‌സ് ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്‌ഷൻ, qPCR മൂന്ന് ഘട്ടങ്ങൾ, ഓരോ ഘട്ടത്തിലും ധാരാളം മുൻകരുതലുകൾ ഉണ്ട്, ഞങ്ങൾ വിശദമായി ചുവടെ അവതരിപ്പിക്കും.

Ⅰ.RNA ഗുണനിലവാര വിലയിരുത്തൽ

RT-qPCR പരീക്ഷണത്തിൽ, RNA വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ പൂർത്തിയാക്കിയ ശേഷം, RNA-യുടെ ഗുണനിലവാരം വിലയിരുത്തേണ്ടതുണ്ട്, അത് യോഗ്യത നേടിയ ശേഷം മാത്രമേ തുടർ പരീക്ഷണം നടത്താൻ കഴിയൂ.മൂല്യനിർണ്ണയ രീതികളിൽ സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ, എജിലന്റ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ്, എജിലന്റ് 2100 വിശകലനം എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു, അവയിൽ ഏറ്റവും സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്ററും അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് രീതി കണ്ടെത്തലും ഉൾപ്പെടുന്നു.ആർ‌എൻ‌എയുടെ ഗുണനിലവാരം ഉറപ്പാക്കുന്നതിന്, ആർ‌എൻ‌എ സാന്ദ്രത, പരിശുദ്ധി, സമഗ്രത എന്നിവ കണ്ടെത്തുന്നതിനും വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിനും ഈ രണ്ട് രീതികളും ഒരുമിച്ച് ഉപയോഗിക്കേണ്ടതുണ്ടെന്ന കാര്യം ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്.

ബന്ധപ്പെട്ട RNA ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ്: 

സെൽ ടോട്ടൽ RNA ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ്

11 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ വിവിധ സംസ്ക്കരിച്ച സെല്ലുകളിൽ നിന്ന് ഉയർന്ന ശുദ്ധീകരിക്കപ്പെട്ടതും ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ളതുമായ മൊത്തം RNA ലഭിക്കും.

അനിമൽ ടോട്ടൽ ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷൻ കിറ്റ്

വിവിധ മൃഗകലകളിൽ നിന്ന് ഉയർന്ന ശുദ്ധവും ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ളതുമായ മൊത്തം RNA വേഗത്തിലും കാര്യക്ഷമമായും വേർതിരിച്ചെടുക്കുക.

സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ:

സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ പ്രധാനമായും ആർഎൻഎയുടെ സാന്ദ്രതയും പരിശുദ്ധിയും നിർണ്ണയിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു, എന്നാൽ ഇതിന് ആർഎൻഎയുടെയും ജീനോമിക് അവശിഷ്ടങ്ങളുടെയും സമഗ്രത കണ്ടെത്താൻ കഴിയില്ല.അവയിൽ, A260/280, A260/230 എന്നിവ ആർഎൻഎ പരിശുദ്ധി കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള പ്രധാന പാരാമീറ്ററുകളാണ്, അവയുടെ മൂല്യങ്ങളുടെ ഏറ്റക്കുറച്ചിലുകൾക്കനുസരിച്ച് ആർഎൻഎ പരിശുദ്ധി കണ്ടെത്താനാകും:

1. 1.9< A260/280< 2.1, RNA പരിശുദ്ധി നല്ലതാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു;A260/280<1.9, RNA-യിൽ പ്രോട്ടീൻ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഉണ്ടാകാമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു;A260/280>2.1, ആർഎൻഎയുടെ ഭാഗികമായ അപചയത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് വഴി കൂടുതൽ സ്ഥിരീകരിക്കാം.

2. 2.0< A260/230< 2.2, RNA പരിശുദ്ധി നല്ലതാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു;A260/230< 2.0, RNA-യിൽ ഫിനോൾസ്, എത്തനോൾ അല്ലെങ്കിൽ ഷുഗർ പോലുള്ള ഓർഗാനിക് റിയാക്ടറുകളുടെ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഉണ്ടാകാമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ്:

അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് അസ്സേയ്ക്ക് ആർഎൻഎ സമഗ്രത, ജീനോം, പ്രോട്ടീൻ അവശിഷ്ടങ്ങൾ എന്നിവ വിശകലനം ചെയ്യാൻ കഴിയും, എന്നാൽ ആർഎൻഎയുടെ സാന്ദ്രത കൃത്യമായി കണക്കാക്കാനോ ഓർഗാനിക് റിയാക്ടറുകളുടെ അവശിഷ്ടങ്ങൾ കണ്ടെത്താനോ കഴിയില്ല.ഉദാഹരണത്തിന് യൂക്കറിയോട്ടിക് RNA ടെംപ്ലേറ്റുകൾ എടുക്കുക:

1. ആർഎൻഎ അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസിന് വിധേയമായി.ജെൽ മാപ്പിൽ 28sRNA, 18sRNA, 5.8sRNA എന്നിവയുടെ മൂന്ന് സിംഗിൾ ബാൻഡുകൾ മാത്രമേ ഉണ്ടായിരുന്നുള്ളൂവെങ്കിൽ, വേർതിരിച്ചെടുത്ത RNA കേടുകൂടാതെയുണ്ടെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.വലിച്ചിടുന്ന പ്രതിഭാസമുണ്ടെങ്കിൽ, അത് ആർഎൻഎയുടെ ഭാഗികമായ അപചയത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

2. ഗ്ലൂ ഹോളിനും 28sRNA ബാൻഡിനും ഇടയിൽ ഒരൊറ്റ ബ്രൈറ്റ് ബാൻഡ് ഉണ്ടെങ്കിൽ, ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഉണ്ടാകാം.

3. പശ ദ്വാരത്തിൽ ബാൻഡുകൾ പ്രത്യക്ഷപ്പെടുകയാണെങ്കിൽ, പ്രോട്ടീനുകളുടെയും മറ്റ് മാക്രോമോളിക്യുലാർ വസ്തുക്കളുടെയും അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഉണ്ടാകാമെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

Ⅱ. റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ

ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ പൂർത്തിയായ ശേഷം, തുടർന്നുള്ള പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി അത് സിഡിഎൻഎയിലേക്ക് മാറ്റേണ്ടതുണ്ട്, അതിനാൽ റിവേഴ്സൽ ഘട്ടം അത്യാവശ്യമാണ്.റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ, പ്രൈമർ എന്നിവയുടെ തിരഞ്ഞെടുപ്പിൽ നിന്ന് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ അവതരിപ്പിക്കും:

റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് തിരഞ്ഞെടുക്കൽ:

സാധാരണ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റസുകളിൽ AMV RTase, MMLV RTase എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു.AMV RTase-ന്റെ RNase H-ന് ശക്തമായ പ്രവർത്തനവും ചെറിയ സിന്തസിസ് ദൈർഘ്യവും കുറഞ്ഞ സിന്തസിസ് അളവും നല്ല താപ സ്ഥിരതയും (42 ~ 55℃) ഉണ്ട്.MMLV RTase-ന്റെ RNase H പ്രവർത്തനം ദുർബലമാണ്, സിന്തസിസ് ദൈർഘ്യം ദൈർഘ്യമേറിയതാണ്, സിന്തസിസ് തുക കൂടുതലാണ്, താപ സ്ഥിരത മോശമാണ് (37 ~ 42℃).

RNase H എൻസൈമിന് RNA ടെംപ്ലേറ്റിനെ തരംതാഴ്ത്തുന്ന പ്രവർത്തനം ഉള്ളതിനാൽ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സമയത്ത് ദുർബലമായ RNase H പ്രവർത്തനമുള്ള MMLV മുൻഗണന നൽകണം, പിന്നീട് ജനിതക എഞ്ചിനീയറിംഗിന് ശേഷം, MMLV യുടെ താപ സ്ഥിരത ഒരു ഗുണപരമായ കുതിച്ചുചാട്ടത്തിലെത്തി.ഫോർജീൻ എടുക്കൽഫോർയേസി റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് (റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനുള്ള എം-എംഎൽവി) ഒരു ഉദാഹരണമായി, ജനിതക പുനഃസംയോജന സാങ്കേതികവിദ്യ ഉപയോഗിച്ച് ഇ.സിംഗിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് ആർഎൻഎ, ഡിഎൻഎ, അല്ലെങ്കിൽ ആർഎൻഎ:ഡിഎൻഎ ഹൈബ്രിഡ് എന്നിവയിൽ നിന്ന് ഒരു കോംപ്ലിമെന്ററി ഡിഎൻഎ സ്ട്രാൻഡ് സമന്വയിപ്പിക്കുന്ന ഒരു റീകോമ്പിനന്റ് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് ആണ് ഇത്.ഇതിന് RNase H പ്രവർത്തനം, ശക്തമായ സ്ഥിരത, ശക്തമായ RNA അഫിനിറ്റി, ഉയർന്ന ഡിറ്റക്ഷൻ സെൻസിറ്റിവിറ്റി എന്നിവയില്ല.

 

ഫോർയേസി റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് (റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനുള്ള എം-എംഎൽവി)

പ്രൈമറിന്റെ തിരഞ്ഞെടുപ്പ്:

സാധാരണയായി ആർടി പ്രൈമറുകൾ മൂന്ന് വിഭാഗങ്ങളായി തിരിച്ചിരിക്കുന്നു: ഒലിഗോ ഡിടി, റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ, ജീൻ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ.വ്യത്യസ്‌ത പരീക്ഷണ ആവശ്യങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് ഉപയോഗത്തിന് അനുയോജ്യമായ പ്രൈമറുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുക.

1. ടെംപ്ലേറ്റ് യൂക്കറിയോട്ടിക് ഉത്ഭവം ആണെങ്കിൽ, സാധാരണ PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി വൈകി cDNA ഉപയോഗിക്കുന്നുവെങ്കിൽ, Oligo (dT) ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു;തുടർന്നുള്ള പരീക്ഷണം qPCR-ന് മാത്രമാണ് ഉപയോഗിക്കുന്നതെങ്കിൽ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന്റെ കാര്യക്ഷമത മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിന് റാൻഡം പ്രൈമറുകളുമായി ഒലിഗോ (dT) മിക്സ് ചെയ്യാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

2. ടെംപ്ലേറ്റ് പ്രോകാരിയോട്ടുകളിൽ നിന്നാണെങ്കിൽ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനായി റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ജീൻ നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കണം.

Ⅲ.qPCR

ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് രീതികൾ, പ്രൈമർ ഡിസൈൻ തത്വങ്ങൾ, ROX സെലക്ഷൻ, റിയാക്ഷൻ സിസ്റ്റം കോൺഫിഗറേഷൻ, പ്രതികരണ സാഹചര്യങ്ങളുടെ ക്രമീകരണം മുതലായവയിൽ നിന്നാണ് ഫ്ലൂറസെൻസ് ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ പ്രധാനമായും വിശദീകരിക്കുന്നത്.

അളവ് രീതികളുടെ തിരഞ്ഞെടുപ്പ്:

ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് രീതികളെ ആപേക്ഷിക ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് രീതികൾ, കേവല അളവ് രീതികൾ എന്നിങ്ങനെ തിരിച്ചിരിക്കുന്നു.ജീൻ എക്സ്പ്രഷനിൽ ചില ചികിത്സാ രീതികളുടെ പ്രഭാവം കണ്ടെത്താനും വ്യത്യസ്ത സമയങ്ങളിൽ ജീൻ എക്സ്പ്രഷനിലെ വ്യത്യാസം കണ്ടെത്താനും വ്യത്യസ്ത ടിഷ്യൂകളിലെ ജീൻ എക്സ്പ്രഷനിലെ വ്യത്യാസം താരതമ്യം ചെയ്യാനും ആപേക്ഷിക അളവ് ഉപയോഗിക്കാം.സമ്പൂർണ അളവെടുപ്പിന് വൈറസിലെ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡിന്റെ അളവും മറ്റും കണ്ടെത്താനാകും.പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തുമ്പോൾ, നമ്മുടെ സ്വന്തം പരീക്ഷണങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് ഉചിതമായ അളവ് രീതികൾ തിരഞ്ഞെടുക്കണം.

പ്രൈമർ ഡിസൈൻ തത്വങ്ങൾ:

qPCR-നുള്ള പ്രൈമറിന്റെ രൂപകൽപ്പന ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയുമായും ഉൽപ്പന്ന സവിശേഷതയുമായും നേരിട്ട് ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.അതിനാൽ, നല്ല പ്രൈമറുകൾ ശരിയായി രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുന്നത് വിജയകരമായ qPCR-ന്റെ ആദ്യപടിയാണ്.പ്രൈമറിന്റെ രൂപകൽപ്പനയിൽ, പരമ്പരാഗത പ്രൈമർ ഡിസൈനിന്റെ തത്വം പാലിക്കുമ്പോൾ ഇനിപ്പറയുന്ന തത്വങ്ങൾ ശ്രദ്ധിക്കണം:

1. ടാർഗെറ്റ് ശകലത്തിന്റെ ദൈർഘ്യം 100 നും 300 bp നും ഇടയിൽ നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നു;

2. ജീനോമിക് ഡിഎൻഎയുടെ സ്വാധീനം ഒഴിവാക്കാൻ ക്രോസ്-എക്സോൺ ഡിസൈൻ;

3. രൂപകല്പന ചെയ്ത പ്രൈമറുകൾ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയ്ക്കായി പരീക്ഷിക്കേണ്ടതുണ്ട്, കൂടാതെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത സ്റ്റാൻഡേർഡിൽ (90-110%) എത്തുമ്പോൾ മാത്രമേ അവ അളവ് പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക് ഉപയോഗിക്കാൻ കഴിയൂ;

4. പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷൻ സാധാരണയായി 0.1uM നും 1.0uM നും ഇടയിൽ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യപ്പെടുന്നു.

ന്റെ തിരഞ്ഞെടുപ്പ്റോക്സ്:

ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് റിയാക്ഷൻ പ്രക്രിയയിൽ, ROX-ന് ഒപ്റ്റിക്കൽ പാത്ത് വ്യത്യാസം, പൈപ്പറ്റിംഗ് പിശക് അല്ലെങ്കിൽ ബാഷ്പീകരണം, ഘനീഭവിക്കൽ എന്നിവ മൂലമുണ്ടാകുന്ന വോളിയം വ്യത്യാസം ഒരുപോലെ ക്രമീകരിക്കാനും ഫലങ്ങളുടെ ആവർത്തനക്ഷമത മെച്ചപ്പെടുത്താനും കഴിയും.എന്നിരുന്നാലും, ROX ന്റെ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് ഉപകരണവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്.qPCR ഉപകരണത്തിന് ദ്വാരങ്ങൾ തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസം യാന്ത്രികമായി ശരിയാക്കാനുള്ള പ്രവർത്തനമുണ്ടെങ്കിൽ, അതിന് ROX ചേർക്കേണ്ടതില്ല;അല്ലെങ്കിൽ, ഇതിന് ROX തിരുത്തൽ ചേർക്കേണ്ടതുണ്ട്.റിയാജന്റുകൾ വാങ്ങുന്നതിലെ ചെറിയ പങ്കാളികൾ ശരിയായ ROX തിരഞ്ഞെടുക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഉപകരണം അനുസരിച്ചായിരിക്കണം, പിന്നീടുള്ള തെറ്റുകൾ ഒഴിവാക്കുക.

പ്രതികരണ സംവിധാനം തയ്യാറാക്കൽ:

20ul, 50ul എന്നിവയുടെ പ്രതികരണ വോള്യങ്ങളാണ് അഭികാമ്യം.സിസ്റ്റം രൂപപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ഇനിപ്പറയുന്ന കാര്യങ്ങൾ ശ്രദ്ധിക്കണം:

1. അൾട്രാ ക്ലീൻ വർക്ക് ബെഞ്ചിലെ വെന്റിലേഷൻ വഴി പ്രതികരണ സംവിധാനം തയ്യാറാക്കേണ്ടതുണ്ട്, പുതിയ ഡിഡിഎച്ച്₂ഓരോ പരീക്ഷണത്തിനും O ഉപയോഗിക്കുന്നു;

2. ഓരോ പരീക്ഷണത്തിനും സിസ്റ്റത്തിൽ മലിനീകരണമുണ്ടോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ NTC തയ്യാറാക്കേണ്ടതുണ്ട്, കൂടാതെ സിസ്റ്റം തയ്യാറാക്കുമ്പോൾ ഓരോ ജോഡി പ്രൈമറുകളും NTC ചെയ്യേണ്ടതുണ്ട്;

3. RNA ടെംപ്ലേറ്റിൽ gDNA അവശിഷ്ടം ഉണ്ടോ എന്ന് കണ്ടുപിടിക്കാൻ, ഓരോ സാമ്പിളിനും കണ്ടുപിടിക്കാൻ NRT തയ്യാറാക്കാം;

4. സിസ്റ്റം തയ്യാറാക്കുമ്പോൾ, ഒരു സാമ്പിളിനായി കുറഞ്ഞത് 3 സാങ്കേതിക ആവർത്തനങ്ങളെങ്കിലും ചെയ്യാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു;

5. ടെംപ്ലേറ്റ് cDNA ആയിരിക്കുമ്പോൾ, qPCR പരീക്ഷണത്തിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സിസ്റ്റത്തിന്റെ ഇൻഹിബിഷൻ പ്രഭാവം കുറയ്ക്കുന്നതിന് 5-10 തവണ നേർപ്പിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.ടെംപ്ലേറ്റ് അളവ് ഗ്രേഡിയന്റ് ഉപയോഗിച്ച് പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യുന്നതാണ് നല്ലത്, അതുവഴി CT മൂല്യം 20-30 ന് ഇടയിൽ കുറയുന്നു;

6. പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളുടെ ആവശ്യമായ എണ്ണം നിർണ്ണയിക്കുക, പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളുടെ എണ്ണത്തിന്റെ അടിസ്ഥാനത്തിൽ 5-10% വർദ്ധിപ്പിക്കുക, വോളിയം കോൺഫിഗറേഷൻ നമ്പർ കണക്കാക്കുക;

7, സിസ്റ്റം പ്രീമിക്സ് തത്വം ഉപയോഗിച്ചാണ് തയ്യാറാക്കിയിരിക്കുന്നത്, സെന്റീഫഗേഷനു ശേഷം മിക്സ് ചെയ്ത് കുമിളകൾ ഇല്ലെന്ന് ഉറപ്പാക്കുന്നു;

8, കഴിയുന്നത്ര സഹായകമായ ഉപഭോഗവസ്തുക്കൾ തിരഞ്ഞെടുക്കാൻ.

ബന്ധപ്പെട്ട RT-qPCR കിറ്റ്