qRT-PCR പരീക്ഷണം, പ്രൈമർ ഡിസൈൻ, ഫല വ്യാഖ്യാനം മുതലായവയുടെ തത്വത്തെക്കുറിച്ചാണ് എല്ലാവരും സംസാരിക്കുന്നത്, എന്നാൽ qRT-PCR-ന്റെ പരീക്ഷണാത്മക പ്രവർത്തനം നിങ്ങളുമായി പങ്കിടണമെന്ന് ഞാൻ കരുതുന്നു.ഇത് ചെറുതാണ്, പക്ഷേ ഇത് ഫലങ്ങളെക്കുറിച്ചാണ്.
qRT-PCR ചെയ്യുന്നതിനു മുമ്പ്, നമ്മുടെ സ്വന്തം RNA, പ്രവർത്തന രീതികൾ എന്നിവയെക്കുറിച്ച് നമുക്ക് വ്യക്തമായ ധാരണ ഉണ്ടായിരിക്കണം.എല്ലാത്തിനുമുപരി, ഞങ്ങളുടെ ശ്രമങ്ങൾ ലളിതമായി പരിശീലിക്കുന്നതിനുപകരം ഫലങ്ങൾ നേടുന്നതിന് ലക്ഷ്യമിടുന്നു.അതിനാൽ qRT-PCR ചെയ്യുന്നതിന് മുമ്പ്, ഇനിപ്പറയുന്ന പ്രശ്നങ്ങൾ ഞങ്ങൾ നിർണ്ണയിക്കേണ്ടതുണ്ട് (അവയിൽ ചിലത് SYBR-ന് മാത്രം ബാധകമാണ്).
1 നിങ്ങളുടെ ആർഎൻഎ തരംതാഴ്ന്നിട്ടില്ലെന്ന് ഉറപ്പാണോ?
നാനോഡ്രോപ്പ് 2000 ന് ആർഎൻഎയുടെ സാന്ദ്രതയും പരിശുദ്ധിയും മാത്രമേ കണ്ടെത്താൻ കഴിയൂ, എന്നാൽ ആർഎൻഎയുടെ സമഗ്രത കണ്ടെത്താൻ കഴിയില്ല.
ആർഎൻഎ (ആർഎൻഎ ഇന്റിസിറ്റി നമ്പർ) മൂല്യം ആർഎൻഎയുടെ സമഗ്രതയെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കും, ഇത് എജിലന്റ് 2100 ബയോഅനലൈസർ സിസ്റ്റം കണ്ടെത്തി.
ചിത്രം. വ്യത്യസ്ത RNA സാമ്പിളുകൾക്കുള്ള RIN മൂല്യങ്ങളുടെ സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം (യൂക്കറിയോട്ടുകൾ)
എന്നിരുന്നാലും, ലബോറട്ടറികളിൽ പൊതുവെ എജിലന്റ് 2100 ബയോഅനലൈസർ ഇല്ല.ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഫോർമാൽഡിഹൈഡ് ജെൽ വഴി നമുക്ക് കണ്ടുപിടിക്കാൻ കഴിയും, എന്നാൽ ആർഎൻഎയുടെ ആകെ തുകയുടെ ആവശ്യകത ഉയർന്നതാണ്, അതിനാൽ സാധാരണ ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ഉപയോഗിക്കുന്നതാണ് ഏറ്റവും വേഗതയേറിയ രീതി.ന്യൂക്ലിയസ് ഇല്ലാത്ത അന്തരീക്ഷത്തിൽ ആയിരിക്കേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്, അതിനാൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ടാങ്ക്, സോൾ ബോട്ടിൽ, ജെൽ ബ്രാക്കറ്റ്, ചീപ്പ് എന്നിവ ഡിഇപിസി വെള്ളത്തിൽ കഴുകേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്.അഗറോസ് ന്യൂക്ലിയസ് രഹിതമാണ് (അത് പുതുതായി തുറന്നിരിക്കുന്നിടത്തോളം കാലം), ലോഡിംഗ് ബഫർ 1.2% ജെൽ ഉപയോഗിച്ച് കഴിയുന്നത്ര പുതുതായി തുറക്കണം.
ചിത്രത്തിൽ സാമ്പിൾ 9 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, ജെൽ പൂർണ്ണമായും അലിഞ്ഞുപോകണം, അല്ലാത്തപക്ഷം അത് അസമമായ ബാൻഡുകൾക്ക് കാരണമാകും.വോൾട്ടേജ് വളരെ കൂടുതലാണെങ്കിൽ അല്ലെങ്കിൽ കൂടുതൽ നേരം പ്രവർത്തിക്കുന്നത് താപം സൃഷ്ടിക്കുകയും ആർഎൻഎ ഡീഗ്രഡേഷന് കാരണമാവുകയും ചെയ്യും, അതിനാൽ വോൾട്ടേജും സമയവും ന്യായമായ രീതിയിൽ നിയന്ത്രിക്കണം.കൂടാതെ, ജെൽ റണ്ണിംഗിന് സാമ്പിളിൽ ഡിഎൻഎ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഉണ്ടോ എന്ന് കൂടുതൽ നിർണ്ണയിക്കാനാകും, കൂടാതെ വിതരണം ചെയ്യുന്ന കിണറ്റിൽ ധാരാളം ബാൻഡുകൾ ഉണ്ടോ എന്ന് നിരീക്ഷിക്കുകയും ചെയ്യാം.
ചിത്രം.ആർഎൻഎയുടെ ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് കണ്ടെത്തൽ
2 നിങ്ങളുടെ cDNA യുടെ സാന്ദ്രതയെക്കുറിച്ച് നിങ്ങൾക്ക് ഉറപ്പാണോ?
ഓരോ ഇൻവേർഷനും ലഭിക്കുന്ന 20 ul സിസ്റ്റത്തിന്റെ cDNA നേരിട്ട് 20X നേർപ്പിക്കുമ്പോൾ പോസ്റ്റ്-ഡോക്ടറൽ സഹോദരിമാർ 10X നേർപ്പിച്ചതാണ് ലബോറട്ടറിയിലെ വലിയ സഹോദരങ്ങളുടെ അനുഭവം.ഞാൻ സാധാരണയായി സാഹചര്യത്തെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.ഓരോ വ്യക്തിയും സൂചിപ്പിച്ച ആർഎൻഎയുടെ ഗുണനിലവാരം വ്യത്യസ്തമായതിനാൽ, വിപരീത നിലവാരവും വ്യത്യസ്തമാണ്, കൂടാതെ റിവേഴ്സൽ സാങ്കേതികവിദ്യ സ്ഥിരതയുള്ളതായിരിക്കില്ല.
അതിനാൽ ഓരോ തവണയും എനിക്ക് വിപരീതമായ cDNA ലഭിക്കുമ്പോൾ, ഞാൻ ആദ്യം അത് ഏകദേശം 3 തവണ നേർപ്പിക്കും, തുടർന്ന് RT-PCR ചെയ്യാൻ ഹൗസ് കീപ്പിംഗ് ജീൻ ഉപയോഗിക്കും, സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം സാധാരണയായി 25 സൈക്കിളുകളാണ്, നിർദ്ദിഷ്ട സാന്ദ്രത തിരിച്ചറിയാൻ, തുടർന്ന് അന്തിമ നേർപ്പിക്കൽ ഘടകം നിർണ്ണയിക്കുക.
3 നിങ്ങളുടെ പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കാൻ എളുപ്പമാണെന്ന് നിങ്ങൾക്ക് ഉറപ്പാണോ?
ഇതിന് qRT-PCR ന്റെ ഉരുകൽ വക്രം കടന്നുപോകാൻ കഴിയും, പക്ഷേ ഇതിന് ഇപ്പോഴും പണം ചിലവാകും.ധാരാളം പണമില്ലാത്ത ലബോറട്ടറികൾക്ക്, അവർക്ക് ധാരാളം പ്രൈമറുകൾ ലഭിക്കുമ്പോൾ, അവർക്ക് സാധാരണ RT-PCR ഉപയോഗിച്ച് ഇത് ഒരു ബാൻഡ് ആണോ എന്ന് നോക്കാനും പ്രൈമറുകളുടെ പ്രത്യേകത തിരിച്ചറിയാനും കഴിയും.ലബോറട്ടറിക്ക് പണം കുറവല്ലെങ്കിൽ, എല്ലാ പ്രൈമറുകളുടെയും പ്രത്യേകതകൾ ഉരുകുന്ന വക്രത്തിലൂടെ ഒരിക്കൽ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയും.
4 നിങ്ങളുടെ പരീക്ഷണ സാഹചര്യങ്ങൾ അനുയോജ്യമാണെന്ന് ഉറപ്പാണോ?
SYBR ശക്തമായ വെളിച്ചത്തിൽ നിന്ന് സംരക്ഷിക്കപ്പെടണം, അതിനാൽ SYBR റീജന്റ് ചേർക്കുമ്പോൾ ഓവർഹെഡ് ലൈറ്റ് ഓഫ് ചെയ്യാൻ ശ്രമിക്കുക, അത് പൂർത്തിയാക്കാൻ മങ്ങിയ വെളിച്ചം മാത്രം ഉപയോഗിക്കേണ്ടതുണ്ട്.
4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ SYBR സംഭരിക്കുക.ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, മൃദുവായി മുകളിലേക്കും താഴേക്കും തിരിയുക, നുരയെ ഉണ്ടാകാതിരിക്കാൻ നന്നായി ഇളക്കുക, ശക്തമായി ചുഴറ്റരുത്.
ചില ഇളയ സഹോദരിമാർ സാമ്പിളുകൾ കലർത്തുമെന്ന് ഭയന്ന് പിസിആർ ബോർഡിൽ മാർക്ക് വരയ്ക്കാൻ ഇഷ്ടപ്പെടുന്നു, അത് തെറ്റാണ്.ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലുകളുടെ ശേഖരണത്തെ നിങ്ങളുടെ മാർക്കറുകൾ ബാധിക്കാൻ സാധ്യതയുള്ളതിനാൽ, ചുവടെ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, മെമ്മറിയിൽ സഹായിക്കുന്നതിന് പരീക്ഷണാത്മക നോട്ട്ബുക്കുകൾ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞാൻ സാധാരണയായി ജൂനിയർമാരെ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.
ചിത്രം.qRT-PCR സാമ്പിൾ ലോഡിംഗ് ഡയഗ്രം
5 നിങ്ങൾ ചെയ്യുന്നത് ശരിയാണെന്ന് ഉറപ്പാണോ?
കയ്യുറകൾ ധരിക്കുക, കയ്യുറകൾ ധരിക്കുക, കയ്യുറകൾ ധരിക്കുക, പ്രധാനപ്പെട്ട കാര്യങ്ങൾ മൂന്ന് തവണ പറയുക.
SYBR-ന്റെ പ്രകാശത്തിലേക്കുള്ള എക്സ്പോഷർ കുറയ്ക്കുന്നതിന്, ചുവടെയുള്ള ചിത്രത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ആദ്യം ഒരു ടെംപ്ലേറ്റ് ചേർക്കാൻ ഞാൻ വ്യക്തിപരമായി ആഗ്രഹിക്കുന്നു.അനുഭവം അനുസരിച്ച്, ചെറിയ അളവിൽ ടെംപ്ലേറ്റ് ചേർക്കുന്നത് സാമ്പിൾ പിശകുകൾക്ക് കാരണമാകും.അതിനാൽ, ചെറിയ അളവിൽ ടെംപ്ലേറ്റ് ചേർക്കുന്നത് മൂലമുണ്ടാകുന്ന പിശക് കുറയ്ക്കുന്നതിന്, ഞാൻ സാധാരണയായി സാമ്പിൾ വീണ്ടും ഇരട്ടിയാക്കുന്നു, കൂടാതെ H2O2 ചേർത്തതിന്റെ അളവ് കുറയ്ക്കുന്നതിന് സാമ്പിൾ ചേർക്കുമ്പോൾ തുക ഇരട്ടിയാക്കുന്നു.
ചിത്രം.qRT-PCR ലോഡിംഗിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം
തുടർന്ന് qRT-PCR സിസ്റ്റം ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ ക്രമീകരിക്കുക.
ചിത്രം.qRT-PCR സിസ്റ്റം തയ്യാറാക്കൽ ഡയഗ്രം
ശ്രദ്ധിക്കുക: കോൺഫിഗറേഷൻ പ്രക്രിയ ഐസിൽ ചെയ്യേണ്ടതുണ്ട്.
സാമ്പിൾ ചേർത്ത ശേഷം, സുതാര്യമായ സീലിംഗ് ഫിലിം ഒട്ടിക്കുക.നിങ്ങളുടെ കൈകൊണ്ട് സുതാര്യമായ സീലിംഗ് ഫിലിമിന്റെ ഉപരിതലത്തിൽ സ്പർശിക്കാതിരിക്കാൻ ശ്രമിക്കുക, ഫിലിമിന്റെ ഇരുവശത്തുമുള്ള സ്ഥലത്ത് നിന്ന് മാത്രം പ്രവർത്തിക്കുക.കാരണം വിരലടയാളം ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലുകളുടെ ശേഖരണത്തെയും ബാധിച്ചേക്കാം.സാമ്പിൾ ഭിത്തിയിൽ തൂങ്ങിക്കിടക്കുന്നത് തടയാൻ, കുറഞ്ഞ വേഗതയിൽ 10 സെക്കൻഡ് വേഗത്തിൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യാൻ ഒരു സെൻട്രിഫ്യൂജ് ഉപയോഗിക്കുക.
ബന്ധപ്പെട്ട ഉല്പന്നങ്ങൾ:
പോസ്റ്റ് സമയം: ഏപ്രിൽ-28-2023
