30 വർഷത്തിലധികം ചരിത്രമുള്ള ഇൻ-വിട്രോ ഡിഎൻഎ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സാങ്കേതികവിദ്യകളിൽ ഒന്നാണ് പിസിആർ (പോളിമറേസ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ).

1983-ൽ യു.എസ്.എയിലെ സെറ്റസിലെ കാരി മുള്ളിസ് ആണ് PCR സാങ്കേതികവിദ്യയ്ക്ക് തുടക്കമിട്ടത്. 1985-ൽ മുള്ളിസ് PCR പേറ്റന്റിന് അപേക്ഷിക്കുകയും അതേ വർഷം തന്നെ ശാസ്ത്രത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ആദ്യത്തെ PCR അക്കാദമിക് പേപ്പർ പ്രസിദ്ധീകരിക്കുകയും ചെയ്തു.മുള്ളിസിന് 1993-ൽ രസതന്ത്രത്തിനുള്ള നോബൽ സമ്മാനം ലഭിച്ചു.

പിസിആറിന്റെ അടിസ്ഥാന തത്വങ്ങൾ

പിസിആറിന് ലക്ഷ്യ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളെ ഒരു ദശലക്ഷത്തിലധികം തവണ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.പാരന്റ് സ്‌ട്രാൻഡ് ഡിഎൻഎ ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായും സ്പെസിഫിക് പ്രൈമർ വിപുലീകരണത്തിന്റെ ആരംഭ പോയിന്റായും ഉപയോഗിക്കുന്ന ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെ ഉത്തേജനത്തിന് കീഴിലാണ് ഈ തത്വം.ഡീനാറ്ററേഷൻ, അനീലിംഗ്, എക്സ്റ്റൻഷൻ തുടങ്ങിയ ഘട്ടങ്ങളിലൂടെ ഇത് വിട്രോയിൽ ആവർത്തിക്കുന്നു.പാരന്റ് സ്‌ട്രാൻഡ് ടെംപ്ലേറ്റ് ഡിഎൻഎയ്ക്ക് പൂരകമായ മകൾ സ്‌ട്രാൻഡ് ഡിഎൻഎയുടെ പ്രക്രിയ.

സ്റ്റാൻഡേർഡ് പിസിആർ പ്രക്രിയയെ മൂന്ന് ഘട്ടങ്ങളായി തിരിച്ചിരിക്കുന്നു:

1. ഡീനാറ്ററേഷൻ: ഡിഎൻഎ ഇരട്ട സരണികൾ വേർതിരിക്കുന്നതിന് ഉയർന്ന താപനില ഉപയോഗിക്കുക.ഉയർന്ന ഊഷ്മാവിൽ (93-98℃) ഡിഎൻഎ ഇരട്ട സരണികൾ തമ്മിലുള്ള ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ട് തകരുന്നു.

2.അനിയലിംഗ്: ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ വേർപെടുത്തിയ ശേഷം, താപനില കുറയ്ക്കുക, അതുവഴി പ്രൈമറിന് സിംഗിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.

3.വിപുലീകരണം: ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ്, ഊഷ്മാവ് കുറയുമ്പോൾ ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന പ്രൈമറുകളിൽ നിന്ന് ഡിഎൻഎ സ്ട്രോണ്ടുകൾക്കൊപ്പം പൂരക സരണികൾ സമന്വയിപ്പിക്കാൻ തുടങ്ങുന്നു.വിപുലീകരണം പൂർത്തിയാകുമ്പോൾ, ഒരു സൈക്കിൾ പൂർത്തിയാകും, ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ എണ്ണം ഇരട്ടിയാകുന്നു

ഈ മൂന്ന് ഘട്ടങ്ങൾ 25-35 തവണ ആവർത്തിക്കുമ്പോൾ, ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ എണ്ണം ക്രമാതീതമായി വർദ്ധിക്കും.

വ്യത്യസ്ത ടാർഗെറ്റ് ജീനുകൾക്കായി വ്യത്യസ്ത പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യാൻ കഴിയും എന്നതാണ് പിസിആറിന്റെ ചാതുര്യം, അതിനാൽ ടാർഗെറ്റ് ജീൻ ശകലങ്ങൾ ചുരുങ്ങിയ സമയത്തിനുള്ളിൽ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.

ഇതുവരെ, പിസിആറിനെ സാധാരണ പിസിആർ, ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ, ഡിജിറ്റൽ പിസിആർ എന്നിങ്ങനെ മൂന്ന് വിഭാഗങ്ങളായി തിരിക്കാം.

സാധാരണ പിസിആറിന്റെ ആദ്യ തലമുറ

ടാർഗെറ്റ് ജീൻ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് ഒരു സാധാരണ PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉപകരണം ഉപയോഗിക്കുക, തുടർന്ന് ഉൽപ്പന്നം കണ്ടെത്തുന്നതിന് അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ഉപയോഗിക്കുക, ഗുണപരമായ വിശകലനം മാത്രമേ ചെയ്യാൻ കഴിയൂ.

ആദ്യ തലമുറ PCR ന്റെ പ്രധാന പോരായ്മകൾ:

1. നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും തെറ്റായ പോസിറ്റീവ് ഫലങ്ങളും ഉണ്ടാകാനുള്ള സാധ്യത.

2. കണ്ടെത്തൽ വളരെ സമയമെടുക്കും, പ്രവർത്തനം ബുദ്ധിമുട്ടുള്ളതുമാണ്.

3. ഗുണപരമായ പരിശോധന മാത്രമേ നടത്താനാകൂ

രണ്ടാം തലമുറ തത്സമയ പിസിആർ

qPCR എന്നറിയപ്പെടുന്ന റിയൽ-ടൈം PCR, പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിന്റെ പുരോഗതി സൂചിപ്പിക്കാൻ കഴിയുന്ന ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലുകളുടെ ശേഖരണത്തിലൂടെ ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ശേഖരണം നിരീക്ഷിക്കുകയും ഫ്ലൂറസെൻസ് കർവ് വഴി ഫലങ്ങൾ വിലയിരുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.Cq മൂല്യത്തിന്റെയും സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവിന്റെയും സഹായത്തോടെ ഇത് കണക്കാക്കാം.

qPCR സാങ്കേതികവിദ്യ ഒരു അടച്ച സംവിധാനത്തിൽ നടപ്പിലാക്കുന്നതിനാൽ, മലിനീകരണത്തിന്റെ സാധ്യത കുറയുന്നു, കൂടാതെ ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നൽ അളവ് കണ്ടെത്തുന്നതിന് നിരീക്ഷിക്കാൻ കഴിയും, അതിനാൽ ഇത് ക്ലിനിക്കൽ പ്രാക്ടീസിൽ ഏറ്റവും വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കപ്പെടുന്നതും പിസിആറിലെ പ്രബലമായ സാങ്കേതികവിദ്യയായി മാറിയിരിക്കുന്നു.

തത്സമയ ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആറിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഫ്ലൂറസെന്റ് പദാർത്ഥങ്ങളെ തക്മാൻ ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബ്, മോളിക്യുലർ ബീക്കണുകൾ, ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈ എന്നിങ്ങനെ വിഭജിക്കാം.

1)തഖ്മാൻ ഫ്ലൂറസെന്റ് അന്വേഷണം:

പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സമയത്ത്, ഒരു ജോടി പ്രൈമർ ചേർക്കുമ്പോൾ ഒരു പ്രത്യേക ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബ് ചേർക്കുന്നു.അന്വേഷണം ഒരു ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡാണ്, രണ്ട് അറ്റങ്ങളും ഒരു റിപ്പോർട്ടർ ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പും ഒരു ക്വഞ്ചർ ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പും ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്തിരിക്കുന്നു.

അന്വേഷണം കേടുകൂടാതെയിരിക്കുമ്പോൾ, റിപ്പോർട്ടർ ഗ്രൂപ്പ് പുറപ്പെടുവിക്കുന്ന ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നൽ ക്വഞ്ചിംഗ് ഗ്രൂപ്പ് ആഗിരണം ചെയ്യുന്നു;പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സമയത്ത്, ടാക്ക് എൻസൈമിന്റെ 5′-3′ എക്സോന്യൂക്ലീസ് പ്രവർത്തനം അന്വേഷണത്തെ പിളർത്തുകയും ഡീഗ്രേഡ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് റിപ്പോർട്ടർ ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പും ക്വൻസറും ആക്കുന്നു, ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പിനെ വേർതിരിക്കുന്നു, അങ്ങനെ ഫ്ലൂറസെൻസ് മോണിറ്ററിംഗ് സിസ്റ്റത്തിന് ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നൽ സ്വീകരിക്കാൻ കഴിയും, അതായത്, ഓരോ തവണയും ഡി.എൻ.എ. ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നലിന്റെ ലേഷൻ പിസിആർ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ രൂപീകരണവുമായി പൂർണ്ണമായും സമന്വയിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു.

2) SYBR ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈ:

PCR പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിൽ, SYBR ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈ അധികമായി ചേർക്കുന്നു.SYBR ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈ ഡിഎൻഎ ഡബിൾ സ്‌ട്രാൻഡിൽ പ്രത്യേകമായി ഉൾപ്പെടുത്താത്തതിന് ശേഷം, അത് ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നൽ പുറപ്പെടുവിക്കുന്നു.ശൃംഖലയിൽ ഉൾപ്പെടുത്താത്ത SYBR ഡൈ തന്മാത്ര ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലും പുറപ്പെടുവിക്കില്ല, അതുവഴി ഫ്ലൂറസന്റ് സിഗ്നൽ ഉറപ്പാക്കുന്നു PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ വർദ്ധനവ് PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ വർദ്ധനവുമായി പൂർണ്ണമായും സമന്വയിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു.SYBR ഇരട്ട സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎയുമായി മാത്രമേ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നുള്ളൂ, അതിനാൽ PCR പ്രതികരണം നിർദ്ദിഷ്ടമാണോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ ഉരുകൽ വക്രം ഉപയോഗിക്കാം.

3) മോളിക്യുലാർ ബീക്കൺ:

ഇത് ഒരു സ്റ്റെം-ലൂപ്പ് ഡബിൾ-ലേബൽ ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് പ്രോബ് ആണ്, ഇത് 5, 3 അറ്റങ്ങളിൽ ഏകദേശം 8 ബേസുകളുള്ള ഒരു ഹെയർപിൻ ഘടന ഉണ്ടാക്കുന്നു.രണ്ട് അറ്റത്തിലുമുള്ള ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് സീക്വൻസുകൾ പരസ്പര പൂരകമായി ജോടിയാക്കുന്നു, ഇത് ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പും ക്വഞ്ചിംഗ് ഗ്രൂപ്പും ഇറുകിയതാക്കുന്നു.അടയ്ക്കുക, ഫ്ലൂറസെൻസ് ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കില്ല.

പിസിആർ ഉൽപന്നം ഉൽപ്പാദിപ്പിച്ച ശേഷം, അനീലിംഗ് പ്രക്രിയയിൽ, തന്മാത്രാ ബീക്കണിന്റെ മധ്യഭാഗം ഒരു പ്രത്യേക ഡിഎൻഎ സീക്വൻസുമായി ജോടിയാക്കുന്നു, ഫ്ലൂറസെന്റ് ജീനിനെ ഫ്ലൂറസെൻസ് ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിന് ക്വഞ്ചർ ജീനിൽ നിന്ന് വേർതിരിക്കുന്നു.

രണ്ടാം തലമുറ PCR ന്റെ പ്രധാന പോരായ്മകൾ:

സംവേദനക്ഷമത ഇപ്പോഴും കുറവാണ്, കൂടാതെ കുറഞ്ഞ പകർപ്പ് മാതൃകകൾ കണ്ടെത്തുന്നത് കൃത്യമല്ല.

പശ്ചാത്തല മൂല്യത്തിന്റെ സ്വാധീനമുണ്ട്, ഫലം ഇടപെടലിന് വിധേയമാണ്.

പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിൽ PCR ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ഉള്ളപ്പോൾ, കണ്ടെത്തൽ ഫലങ്ങൾ ഇടപെടലിന് വിധേയമാണ്.

മൂന്നാം തലമുറ ഡിജിറ്റൽ പിസിആർ

ഡിജിറ്റൽ PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) എൻഡ്-പോയിന്റ് ഡിറ്റക്ഷനിലൂടെ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസിന്റെ പകർപ്പ് നമ്പർ കണക്കാക്കുന്നു, കൂടാതെ ആന്തരിക നിയന്ത്രണങ്ങളും സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവുകളും ഉപയോഗിക്കാതെ കൃത്യമായ സമ്പൂർണ്ണ അളവ് കണ്ടെത്തൽ നടത്താൻ കഴിയും.

ഡിജിറ്റൽ PCR എൻഡ്-പോയിന്റ് ഡിറ്റക്ഷൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു, അത് Ct മൂല്യത്തെ (സൈക്കിൾ ത്രെഷോൾഡ്) ആശ്രയിക്കുന്നില്ല, അതിനാൽ ഡിജിറ്റൽ PCR പ്രതികരണത്തെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത ബാധിക്കില്ല, കൂടാതെ PCR പ്രതികരണ ഇൻഹിബിറ്ററുകളോടുള്ള സഹിഷ്ണുത ഉയർന്ന കൃത്യതയും പുനരുൽപാദനക്ഷമതയും മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നു.

ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമതയുടെയും ഉയർന്ന കൃത്യതയുടെയും സവിശേഷതകൾ കാരണം, ഇത് പിസിആർ റിയാക്ഷൻ ഇൻഹിബിറ്ററുകളാൽ എളുപ്പത്തിൽ ഇടപെടില്ല, കൂടാതെ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഉൽപ്പന്നങ്ങളില്ലാതെ ഇതിന് യഥാർത്ഥ സമ്പൂർണ്ണ അളവ് കൈവരിക്കാൻ കഴിയും, ഇത് ഒരു ഗവേഷണ-ആപ്ലിക്കേഷൻ ഹോട്ട്‌സ്‌പോട്ടായി മാറിയിരിക്കുന്നു.

പ്രതികരണ യൂണിറ്റിന്റെ വിവിധ രൂപങ്ങൾ അനുസരിച്ച്, അതിനെ മൂന്ന് പ്രധാന തരങ്ങളായി തിരിക്കാം: മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക്, ചിപ്പ്, ഡ്രോപ്ലെറ്റ് സിസ്റ്റങ്ങൾ.

1) മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് ഡിജിറ്റൽ PCR, mdPCR:

മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് സാങ്കേതികവിദ്യയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റ് വേർതിരിച്ചിരിക്കുന്നു.മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക് സാങ്കേതികവിദ്യയ്ക്ക് സാമ്പിൾ നാനോ-അപ്‌ഗ്രേഡിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ ചെറിയ തുള്ളികളുടെ ഉത്പാദനം തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയും, എന്നാൽ തുള്ളികൾക്ക് ഒരു പ്രത്യേക അഡോർപ്ഷൻ രീതി ആവശ്യമാണ്, തുടർന്ന് പിസിആർ പ്രതികരണ സംവിധാനവുമായി സംയോജിപ്പിക്കുക.mdPCR മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്ന മറ്റ് രീതികൾ ക്രമേണ സ്വീകരിച്ചു.

2) തുള്ളികൾ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഡിജിറ്റൽ PCR, ddPCR:

സാമ്പിൾ തുള്ളികളായി പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുന്നതിന് വാട്ടർ-ഇൻ-ഓയിൽ ഡ്രോപ്ലെറ്റ് ജനറേഷൻ ടെക്നോളജി ഉപയോഗിക്കുക, കൂടാതെ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് തന്മാത്രകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന പ്രതികരണ സംവിധാനത്തെ ആയിരക്കണക്കിന് നാനോ സ്കെയിൽ ഡ്രോപ്ലെറ്റുകളായി വിഭജിക്കുക, അവയിൽ ഓരോന്നിനും ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ടാർഗെറ്റ് തന്മാത്ര അടങ്ങിയിട്ടില്ല, അല്ലെങ്കിൽ ഒന്ന് മുതൽ നിരവധി ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ടാർഗെറ്റ് തന്മാത്രകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.

3) ചിപ്പ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഡിജിറ്റൽ PCR, cdPCR:

സിലിക്കൺ വേഫറുകളിലോ ക്വാർട്സ് ഗ്ലാസുകളിലോ നിരവധി മൈക്രോട്യൂബുകളും മൈക്രോകാവിറ്റികളും കൊത്തിവയ്ക്കാൻ സംയോജിത ഫ്ലൂയിഡ് പാത്ത്‌വേ സാങ്കേതികവിദ്യ ഉപയോഗിക്കുക, കൂടാതെ വ്യത്യസ്ത നിയന്ത്രണ വാൽവുകളിലൂടെ ലായനിയുടെ ഒഴുക്ക് നിയന്ത്രിക്കുക, കൂടാതെ ഡിജിറ്റൽ പിസിആർ പ്രതികരണത്തിനുള്ള സാമ്പിൾ ദ്രാവകത്തെ അതേ വലുപ്പത്തിലുള്ള നാനോമീറ്ററുകളായി പ്രതികരണ കിണറുകളായി വിഭജിച്ച് സമ്പൂർണ്ണ അളവ് കൈവരിക്കുക.

മൂന്നാം തലമുറ PCR ന്റെ പ്രധാന പോരായ്മകൾ:

ഉപകരണങ്ങളും റിയാക്ടറുകളും ചെലവേറിയതാണ്.

ടെംപ്ലേറ്റ് ഗുണനിലവാര ആവശ്യകതകൾ ഉയർന്നതാണ്.ടെംപ്ലേറ്റ് അളവ് മൈക്രോസിസ്റ്റം അളവിനേക്കാൾ കൂടുതലാണെങ്കിൽ, അത് അളക്കുന്നത് അസാധ്യമായിരിക്കും, അത് വളരെ ചെറുതാണെങ്കിൽ, അളവ് കൃത്യത കുറയും.

നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉണ്ടാകുമ്പോൾ തെറ്റായ പോസിറ്റീവുകളും സൃഷ്ടിക്കപ്പെടാം.