പി.സി.ആർ, ഒന്നിലധികം പി.സി.ആർ, സ്ഥലത്തു PCR, വിപരീത പിസിആർ, ആർടി-പിസിആർ, qPCR (1)–പി.സി.ആർ

വിവിധ PCR-ന്റെ ആശയങ്ങളും ഘട്ടങ്ങളും വിശദാംശങ്ങളും ഞങ്ങൾ അടുക്കും

Ⅰ. പി.സി.ആർ

പിസിആർ എന്നറിയപ്പെടുന്ന പോളിമറേസ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ, പ്രത്യേക ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ വലുതാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു മോളിക്യുലാർ ബയോളജിക്കൽ സാങ്കേതികവിദ്യയാണ്.വിട്രോയിലെ ഒരു പ്രത്യേക ഡിഎൻഎ പകർപ്പായി ഇതിനെ കണക്കാക്കാം.ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് (ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് I) 1955-ൽ തന്നെ കണ്ടെത്തി, പരീക്ഷണാത്മക മൂല്യവും പ്രായോഗികതയും ഉള്ള ഇ.കോളിയുടെ ക്ലെനോ ശകലം 1970-കളുടെ തുടക്കത്തിൽ ഡോ. എച്ച്. ക്ലെനോ കണ്ടെത്തി, എന്നാൽ ഈ എൻസൈം താപനിലയെ സഹിക്കാത്തതിനാൽ ഉയർന്ന താപനില അതിനെ നശിപ്പിച്ചേക്കാം, അതിനാൽ പോളിമറേസ് പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന് വിധേയമാകില്ല.ഇന്ന് ഉപയോഗത്തിലുള്ള എൻസൈമുകൾ (ടാക്ക് പോളിമറേസ് എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്നു), 1976-ൽ തെർമസ് അക്വാട്ടിക്കസ് എന്ന ഹോട്ട് സ്പ്രിംഗ് ബാക്ടീരിയയിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്തതാണ്. ഉയർന്ന ഊഷ്മാവിനെ പ്രതിരോധിക്കാൻ കഴിയും എന്നതാണ് ഇതിന്റെ സവിശേഷത, എന്നാൽ 1980-കൾക്ക് ശേഷം ഇത് വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കപ്പെട്ടു.പിസിആറിന്റെ യഥാർത്ഥ പ്രാകൃത പ്രോട്ടോടൈപ്പിന്റെ യഥാർത്ഥ ആശയം ജീൻ നന്നാക്കലിനും പകർത്തലിനും സമാനമാണ്, ഇത് 1971-ൽ ഡോ. കെജെൽ ക്ലെപ്പെ നിർദ്ദേശിച്ചു. അദ്ദേഹം ആദ്യത്തെ ലളിതവും ഹ്രസ്വകാല ജീൻ കോപ്പിയും പ്രസിദ്ധീകരിച്ചു (പിസിആറിന്റെ ആദ്യ രണ്ട് സൈക്കിൾ പ്രതികരണങ്ങൾക്ക് സമാനമായത്).ഇന്ന് വികസിപ്പിച്ച പിസിആർ 1983-ൽ ഡോ. കാരി ബി. മുള്ളിസ് വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു. ഡോ. മുള്ളിസ് ആ വർഷം പിഇ കമ്പനികൾക്ക് സേവനം നൽകി, അതിനാൽ പിസിആർ വ്യവസായത്തിൽ പിഇക്ക് പ്രത്യേക പദവിയുണ്ട്.ഡോ. മുള്ളിസ് 1985-ൽ സൈക്കിയും മറ്റുള്ളവരുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ആദ്യ പ്രബന്ധം ഔദ്യോഗികമായി പ്രസിദ്ധീകരിച്ചു. അതിനുശേഷം, PCR-ന്റെ ഉപയോഗം പ്രതിദിനം ആയിരക്കണക്കിന് മൈലുകൾ ആണ്, ബന്ധപ്പെട്ട പേപ്പറുകളുടെ ഗുണനിലവാരം മറ്റ് പല ഗവേഷണ രീതികളും അപ്രാപ്യമാക്കുന്നു.തുടർന്ന്, PCR സാങ്കേതികവിദ്യ ജൈവ ശാസ്ത്ര ഗവേഷണത്തിലും ക്ലിനിക്കൽ ആപ്ലിക്കേഷനുകളിലും വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കപ്പെടുന്നു, ഇത് മോളിക്യുലർ ബയോളജി ഗവേഷണത്തിന്റെ ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട സാങ്കേതികവിദ്യയായി മാറുന്നു.1993-ലെ രസതന്ത്രത്തിനുള്ള നോബൽ സമ്മാനവും മുള്ളിസിന് ലഭിച്ചു.

പി.സി.ആർതത്വം

പിസിആർ സാങ്കേതികവിദ്യയുടെ അടിസ്ഥാന തത്വം ഡിഎൻഎയുടെ സ്വാഭാവികമായ പകർപ്പെടുക്കൽ പ്രക്രിയയ്ക്ക് സമാനമാണ്, അതിന്റെ പ്രത്യേകത ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസിൻറെ രണ്ട് അറ്റങ്ങൾക്കും പൂരകമായ ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് പ്രൈമറിനെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.പിസിആർ ഡീജനറേഷൻ-അനിയലിംഗ്-എക്സ്റ്റെൻഡിംഗ് മൂന്ന് അടിസ്ഥാന പ്രതിപ്രവർത്തന ഘട്ടങ്ങൾ ഉൾക്കൊള്ളുന്നു: ① ടെംപ്ലേറ്റ് ഡിഎൻഎയുടെ ഡീജനറേഷൻ: ടെംപ്ലേറ്റ് ഡിഎൻഎ ഒരു നിശ്ചിത സമയത്തേക്ക് ഏകദേശം 93 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ചൂടാക്കിയ ശേഷം, പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ ഡ്യുവൽ ചെയിൻ ഡിഎൻഎയ്ക്കുള്ള ഡ്യുവൽ ഡിഎൻഎ പരിഹാരം.② ടെംപ്ലേറ്റ് ഡിഎൻഎയുടെയും പ്രൈമറിന്റെയും അനീലിംഗ് (സംയുക്തം): ടെംപ്ലേറ്റ് ഡിഎൻഎ ചൂടാക്കി ഒരൊറ്റ ശൃംഖലയായി ജീർണിച്ച ശേഷം, താപനില ഏകദേശം 55 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസായി കുറയുന്നു.പ്രൈമറിന്റെയും ടെംപ്ലേറ്റിന്റെയും ഡിഎൻഎ സിംഗിൾ-ചെയിനിന്റെ കോംപ്ലിമെന്ററി സീക്വൻസ്.③പ്രൈമറിന്റെ വിപുലീകരണം: DNA ടെംപ്ലേറ്റ്-പ്രൈമർ ബൈൻഡിംഗ് TaqDNA പോളിമറേസിന്റെ പ്രവർത്തനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്, dNTP പ്രതികരണ അസംസ്കൃത വസ്തുവാണ്.പകർപ്പെടുക്കൽ തത്വം പാലിക്കുക, ടെംപ്ലേറ്റ് ഡിഎൻഎ ശൃംഖലയെ പൂരകമാക്കുന്ന ഒരു പുതിയ സെമി-റിസർവ്ഡ് കോപ്പി ചെയിൻ സമന്വയിപ്പിക്കുക, ആവർത്തിച്ചുള്ള സൈക്കിൾ ഡീജനറേഷൻ-അനിയലിംഗ്-എക്‌സ്‌റ്റൻഷൻ മൂന്ന് പ്രക്രിയകൾക്ക് കൂടുതൽ “സെമി റിസർവ്ഡ് കോപ്പി ചെയിൻ” ലഭിക്കും, ഈ പുതിയ ശൃംഖല വീണ്ടും ലഭ്യമാണ് അടുത്ത സൈക്കിളിനായി ഒരു ടെംപ്ലേറ്റ് ആകുക.ലൂപ്പ് പൂർത്തിയാക്കാൻ 2-4 മിനിറ്റ് എടുക്കും, ടാർഗെറ്റ് ജീൻ 2-3 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ നിരവധി ദശലക്ഷം തവണ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.

സ്റ്റാൻഡേർഡ്പി.സി.ആർപ്രതികരണ സംവിധാനം

പിസിആർ പ്രതികരണത്തിന്റെ അഞ്ച് ഘടകങ്ങൾ

പിസിആർ പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിൽ പ്രധാനമായും അഞ്ച് തരം പദാർത്ഥങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്നു, അതായത് പ്രൈമർ, എൻസൈം, ഡിഎൻടിപി, ടെംപ്ലേറ്റ്, ബഫർ (Mg2+ ആവശ്യമാണ്).[PCR നടപടിക്രമം]

സ്റ്റാൻഡേർഡ് പിസിആർ പ്രക്രിയയെ മൂന്ന് ഘട്ടങ്ങളായി തിരിച്ചിരിക്കുന്നു

1. ഡിഎൻഎ ഡീജനറേഷൻ (90°C-96°C): താപ പ്രവർത്തനത്തിൻ കീഴിലുള്ള ഡ്യുവൽ-ചെയിൻ ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റുകൾ, ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകൾ തകരുന്നു, ഒരൊറ്റ ചെയിൻ ഡിഎൻഎ രൂപപ്പെടുന്നു.

2. അനീലിംഗ് (25℃ -65℃): സിസ്റ്റത്തിന്റെ താപനില കുറയുന്നു, പ്രൈമർ ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റുമായി സംയോജിപ്പിച്ച് ഒരു ലോക്കൽ ഡ്യുവൽ ചെയിൻ ഉണ്ടാക്കുന്നു.

3. വിപുലീകരണം (70℃ -75℃): Taq എൻസൈമിന്റെ (ഏകദേശം 72°C, മികച്ച പ്രവർത്തനം) പ്രവർത്തനത്തിന് കീഴിൽ, dNTP അസംസ്കൃത വസ്തുവായി ഉപയോഗിക്കുന്നു, പ്രൈമർ → 3′ അറ്റത്തിന്റെ 5′ അവസാനം വരെ നീളുന്നു, സമന്വയവും ടെംപ്ലേറ്റും പരസ്പരം DNA ശൃംഖലയെ പൂരകമാക്കുന്നു.

ഓരോ സൈക്കിളും ഡീനാച്ചർ ചെയ്യപ്പെടുകയും അനീൽ ചെയ്യുകയും വിപുലീകരിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് ഡിഎൻഎ ഉള്ളടക്കം ഇരട്ടിയാക്കുന്നു.നിലവിൽ, ഹ്രസ്വമായ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഏരിയ കാരണം, ടാക്ക് എൻസൈം പ്രവർത്തനം ഒപ്റ്റിമൽ അല്ലെങ്കിലും വളരെ ചുരുങ്ങിയ സമയത്തിനുള്ളിൽ ചില PCR ആവർത്തിക്കാൻ കഴിയും, അതിനാൽ ഇത് രണ്ട് ഘട്ടങ്ങളായി മാറ്റാം, അതായത്, 60 ° C-65 ° C താപനിലയിൽ ഒരേ സമയം അനീലിംഗും വിപുലീകരണവും നടത്താം.ലിഫ്റ്റിംഗ്, കൂളിംഗ് പ്രക്രിയ കുറയ്ക്കുന്നതിനും പ്രതികരണ വേഗത മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനും വേണ്ടി.

PCR പ്രതികരണ സവിശേഷതകൾ

● ഉയർന്ന-പ്രത്യേകത

പിസിആർ പ്രതികരണത്തിന്റെ പ്രത്യേക നിർണായക ഘടകങ്ങൾ ഇവയാണ്: ①പ്രൈമറിന്റെയും ടെംപ്ലേറ്റ് ഡിഎൻഎയുടെയും പ്രത്യേക സംയോജനം.②അടിസ്ഥാന ജോടിയാക്കലിന്റെ തത്വം.③TaqDNA പോളിമറേസ് സിന്തസിസ് പ്രതികരണത്തിന്റെ വിശ്വസ്തത.④ ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ പ്രത്യേകതയും യാഥാസ്ഥിതികതയും.

പ്രൈമറുകളുടെയും ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെയും ശരിയായ സംയോജനമാണ് പ്രധാനം.പ്രൈമറിന്റെയും ടെംപ്ലേറ്റിന്റെയും ബൈൻഡിംഗും പ്രൈമർ ശൃംഖലയുടെ വിപുലീകരണവും ആൽക്കലൈൻ ബേസ് മാച്ചിംഗിന്റെ തത്വത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്.പോളിമറേസ് സിന്തസിസ് പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളുടെ വിശ്വസ്തതയും ടാക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെ ഉയർന്ന താപനില പ്രതിരോധവും, പ്രതികരണത്തിലെ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെയും പ്രൈമറിന്റെയും ബൈൻഡിംഗ് (സംയുക്തം) ഉണ്ടാക്കാൻ ഉയർന്ന താപനിലയിൽ നടത്താൻ കഴിയും.കോമ്പിനേഷന്റെ പ്രത്യേകത വളരെയധികം വർദ്ധിച്ചു.ക്ലിപ്പിന് ഉയർന്ന കൃത്യത നിലനിർത്താൻ കഴിയും.ഉയർന്ന യാഥാസ്ഥിതികതയും ഉയർന്ന യാഥാസ്ഥിതികതയും ഉള്ള ഒരു ടാർഗെറ്റ് ജനിതക മേഖല തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിലൂടെ, അതിന്റെ പ്രത്യേകത ഉയർന്നതാണ്.

● ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമത

PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ഉൽപ്പാദന അളവ് സൂചികയാൽ വർധിപ്പിക്കുന്നു, മൈക്രോഗ്രാം (μg= -6) ലെവലിലേക്ക് മൈക്രോകൺട്രോളറിന്റെ അളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് പിക്കറിന്റെ (PG=10-12) ആരംഭ ടെംപ്ലേറ്റ് വികസിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.1 ദശലക്ഷം സെല്ലുകളിൽ നിന്ന് ഒരു ടാർഗെറ്റ് സെല്ലുകൾ കണ്ടെത്താനാകും;വൈറസുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിൽ, പിസിആറിന്റെ സംവേദനക്ഷമത 3 RFU- കളിൽ എത്താം (ശൂന്യമായ പാടുകൾ രൂപപ്പെട്ട യൂണിറ്റുകൾ);ബാക്ടീരിയൽ സയൻസിലെ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ കണ്ടെത്തൽ നിരക്ക് 3 ബാക്ടീരിയയാണ്.

● ലളിതവും വേഗതയും

PCR പ്രതിഫലനം ഉയർന്ന-താപനിലയുള്ള Taq DNA പോളിമറേസ് ഉപയോഗിക്കുന്നു, അത് ഒരു സമയത്ത് പ്രതിപ്രവർത്തന പരിഹാരം ചേർക്കുന്നു, അതായത്, DNA ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ലായനിയിലും വാട്ടർ ബാത്ത് പോട്ടിലും ഒരു ഡീജനറേഷൻ-അനിയൽ-എക്‌സ്റ്റൻഷൻ പ്രതികരണം.സാധാരണയായി, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രതികരണം 2 മുതൽ 4 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ പൂർത്തിയാകും.ഓഗ്‌മെന്റഡ് ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ സാധാരണയായി ഇലക്ട്രിക്കൽ വാൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് വിശകലനം ചെയ്യുന്നത്, കൂടാതെ ഐസോടോപ്പുകൾ ഉപയോഗിക്കേണ്ടതില്ല, റേഡിയോ ആക്ടീവ് മലിനീകരണമില്ല, എളുപ്പത്തിലുള്ള പ്രമോഷനും.

● മാതൃകയുടെ പരിശുദ്ധി കുറവാണ്

വൈറസുകളോ ബാക്ടീരിയകളോ സംസ്കാര കോശങ്ങളോ വേർതിരിക്കേണ്ട ആവശ്യമില്ല.ഡിഎൻഎ ക്രൂഡ് ഉൽപ്പന്നങ്ങളും ആർഎൻഎയും ആംപ്ലിഫയറുകളായി ഉപയോഗിക്കാം.രക്തം, ശരീര ദ്രാവകം, ചുമ കഴുകുന്ന ദ്രാവകം, മുടി, കോശങ്ങൾ, ജീവനുള്ള ടിഷ്യു തുടങ്ങിയ ക്ലിനിക്കൽ മാതൃകകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഡിഎൻഎ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കണ്ടെത്തൽ നേരിട്ട് ഉപയോഗിക്കാം.

പി.സി.ആർസാധാരണ പ്രശ്നങ്ങൾ

● തെറ്റായ നെഗറ്റീവ്, ആംപ്ലിഫൈഡ് ബാൻഡുകളൊന്നുമില്ല

PCR പ്രതികരണത്തിന്റെ പ്രധാന ഘട്ടങ്ങളിൽ ഇവ ഉൾപ്പെടുന്നു: ① ടെംപ്ലേറ്റ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾ തയ്യാറാക്കൽ, ② പ്രൈമറുകളുടെ ഗുണനിലവാരവും പ്രത്യേകതയും, ③ എൻസൈമുകളുടെ ഗുണനിലവാരം ④ PCR സൈക്കിൾ അവസ്ഥകൾ.കാരണം കണ്ടെത്തുന്നത് മുകളിലുള്ള ലിങ്കുകൾക്കായി വിശകലനം ചെയ്യുകയും പഠിക്കുകയും വേണം.

ടെംപ്ലേറ്റുകൾ: ① ടെംപ്ലേറ്റിൽ വിവിധ പ്രോട്ടീൻ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, ② ടെംപ്ലേറ്റിൽ ഒരു Taq എൻസൈം ഇൻഹിബിറ്റർ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, ③ ടെംപ്ലേറ്റിലെ പ്രോട്ടീൻ ഒഴിവാക്കില്ല, പ്രത്യേകിച്ച് ക്രോമസോമിലെ ഗ്രൂപ്പ് പ്രോട്ടീൻ.⑤ ഡെമിനർ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഡീജനറേഷൻ സമഗ്രമല്ല.എൻസൈമുകളുടെയും പ്രൈമറുകളുടെയും ഗുണനിലവാരം നല്ലതായിരിക്കുമ്പോൾ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡ് ഇല്ല, ഇത് മിക്കവാറും മാതൃകകളുടെ ദഹന ചികിത്സയാണ്.ടെംപ്ലേറ്റ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ പ്രക്രിയയിൽ എന്തോ കുഴപ്പമുണ്ട്, അതിനാൽ ഫലപ്രദവും സുസ്ഥിരവുമായ ദഹന പരിഹാരം തയ്യാറാക്കാൻ, അതിന്റെ നടപടിക്രമം സ്ഥിരപ്പെടുത്തുകയും ഏകപക്ഷീയമായി മാറ്റാതിരിക്കുകയും വേണം.

എൻസൈം നിർജ്ജീവമാക്കൽ: എൻസൈം പ്രവർത്തനം നഷ്ടപ്പെട്ടോ അപര്യാപ്തമോ എന്ന് വിശകലനം ചെയ്യാൻ ഒരു പുതിയ എൻസൈം അല്ലെങ്കിൽ പഴയതും പുതിയതുമായ എൻസൈമുകൾ ഒരുമിച്ച് ഉപയോഗിക്കണം, ഇത് തെറ്റായ നിഷേധങ്ങളിലേക്ക് നയിക്കുന്നു.ടാക്ക് എൻസൈം അല്ലെങ്കിൽ എത്തിഡിയം ബ്രോമൈഡ് ചിലപ്പോൾ മറന്നുപോകുന്നു എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്.

പ്രൈമർ: പ്രൈമറിന്റെ ഗുണനിലവാരം, പ്രൈമറിന്റെ ഏകാഗ്രത, രണ്ട് പ്രൈമറുകളുടെയും ഏകാഗ്രത സമമിതിയാണോ.പിസിആർ പരാജയപ്പെടുന്നതിനുള്ള ഒരു സാധാരണ കാരണം അല്ലെങ്കിൽ വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന ബാൻഡ് അനുയോജ്യമല്ലാത്തതും വ്യാപിക്കാൻ സാധ്യതയുള്ളതുമല്ല.ചില ബാച്ച് നമ്പറുകളുടെ പ്രൈമറുകളുടെ ഗുണനിലവാരത്തിൽ പ്രശ്നങ്ങളുണ്ട്.രണ്ട് പ്രൈമറുകൾക്ക് ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയും കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയും ഉണ്ട്, ഇത് കുറഞ്ഞ കാര്യക്ഷമതയുള്ള അസമമായ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനു കാരണമാകുന്നു.പ്രതിവിധികൾ ഇവയാണ്: ① യൂണിറ്റുകൾ സമന്വയിപ്പിക്കുന്നതിന് ഒരു നല്ല പ്രൈമർ തിരഞ്ഞെടുക്കുക.② പ്രൈമറിന്റെ സാന്ദ്രത OD മൂല്യത്തെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു മാത്രമല്ല, അഗർ ഷുഗർ ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ഉണ്ടാക്കാൻ പ്രൈമറിന്റെ യഥാർത്ഥ ദ്രാവകത്തിലേക്ക് ശ്രദ്ധ ചെലുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.ഒരു പ്രൈമർ സ്ട്രിപ്പ് സോൺ ഉണ്ടായിരിക്കണം, രണ്ട് പ്രൈമറുകളുടെ തെളിച്ചം പൊതുവെ സ്ഥിരതയുള്ളതായിരിക്കണം.ബെൽറ്റ്, PCR ഈ സമയത്ത് പരാജയപ്പെടാം, അത് പ്രൈമർ സിന്തസിസ് യൂണിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് പരിഹരിക്കണം.ഒരു പ്രൈമർ ഉയർന്നതാണെങ്കിൽ, തെളിച്ചം കുറവാണ്, നേർപ്പിക്കുമ്പോൾ അതിന്റെ ഏകാഗ്രത സന്തുലിതമാക്കണം.③ റഫ്രിജറേറ്ററിന്റെ ഒന്നിലധികം ഫ്രീസിങ് അല്ലെങ്കിൽ ദീർഘകാല റഫ്രിജറേഷൻ ഭാഗങ്ങൾ തടയുന്നതിന് പ്രൈമറിന് പണം നൽകുകയും ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിൽ സൂക്ഷിക്കുകയും വേണം, ഇത് പ്രൈമർ നശിക്കുകയും നശിക്കുകയും ചെയ്യും.④ പ്രൈമറിന്റെ രൂപകൽപ്പന യുക്തിരഹിതമാണ്, അതായത് പ്രൈമറിന്റെ നീളം അപര്യാപ്തമാണ്, കൂടാതെ പ്രൈമറുകൾക്കിടയിൽ ഡൈ ക്ലസ്റ്റർ രൂപപ്പെടുന്നു.

Mg2+ ഏകാഗ്രത: PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയിൽ Mg2+ അയോൺ കോൺസൺട്രേഷൻ വലിയ സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നു.അമിതമായ ഏകാഗ്രത പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ എതിർവിഭാഗത്തെ കുറയ്ക്കും.കോൺസൺട്രേഷൻ വളരെ കുറവാണെങ്കിൽ, പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഔട്ട്പുട്ട്, എക്സ്പാൻഷൻ ബാൻഡ് ഇല്ലാതെ തന്നെ പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പരാജയമാക്കും.

പ്രതികരണ വോളിയത്തിന്റെ മാറ്റം: PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷനിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന വോളിയം 20ul, 30ul, 50ul അല്ലെങ്കിൽ 100uL ആണ്, ശാസ്ത്രീയ ഗവേഷണത്തിന്റെയും ക്ലിനിക്കൽ പരിശോധനയുടെയും വിവിധ ആവശ്യങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായുള്ള ആപ്ലിക്കേഷന്റെ വലിയ അളവ് സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.20ul പോലുള്ള ചെറിയ വോള്യങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കിയ ശേഷം, വലിപ്പം ഉണ്ടാക്കുമ്പോൾ ഒരു ചരട് വ്യവസ്ഥ ഉണ്ടാക്കേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്, അല്ലാത്തപക്ഷം അത് പരാജയപ്പെടും.

ശാരീരിക കാരണങ്ങൾ: PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി പരിവർത്തനം വളരെ പ്രധാനമാണ്.ഡീജനറേഷൻ താപനില കുറവാണെങ്കിൽ, ഡീജനറേഷൻ സമയം ചെറുതാണ്, അത് തെറ്റായ നെഗറ്റീവ്കളിൽ സംഭവിക്കാൻ സാധ്യതയുണ്ട്;വളരെ കുറഞ്ഞ അനീലിംഗ് താപനില നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷനു കാരണമാകുകയും നിർദ്ദിഷ്ട ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്യും.പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത കുറയ്ക്കുന്നതിന് പ്രൈമറുകളുടെയും ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെയും സംയോജനത്തെ വളരെയധികം ബാധിക്കുന്നു.ചിലപ്പോൾ പിസിആർ പരാജയപ്പെടാനുള്ള കാരണങ്ങളിലൊന്നായ വിപുലീകരണത്തിലോ വെള്ളത്തിൽ ലയിക്കുന്ന കുക്കറിലോ ഉള്ള വേരിയബിളിറ്റി, അനീലിംഗ്, വിപുലീകൃത താപനില എന്നിവ കണ്ടെത്തുന്നതിന് സ്റ്റാൻഡേർഡ് തെർമോമീറ്ററുകൾ ഉപയോഗിക്കേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്.

ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് വേരിയന്റുകൾ: ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് സംഭവിക്കുകയാണെങ്കിൽ, ഒരു മ്യൂട്ടേഷൻ അല്ലെങ്കിൽ ഇല്ലാതാക്കൽ, പ്രോട്ടോടൈപ്പിന്റെയും ടെംപ്ലേറ്റിന്റെയും സംയോജനം, അല്ലെങ്കിൽ ഒരു ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് ഇല്ലാത്തതിനാൽ, പ്രൈമറിനും ടെംപ്ലേറ്റിനും കോംപ്ലിമെന്ററി സീക്വൻസ് നഷ്ടപ്പെടും, അതിന്റെ പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വിജയിക്കില്ല.

● തെറ്റായ പോസിറ്റീവ്

PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡ് ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് ബാൻഡുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നതായി കാണപ്പെടുന്നു, ചിലപ്പോൾ അതിന്റെ ബാൻഡ് കൂടുതൽ വൃത്തിയും ഉയർന്നതുമാണ്.

പ്രൈമർ ഡിസൈൻ ഉചിതമല്ല: തിരഞ്ഞെടുത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സീക്വൻസും നോൺ-പർപ്പസ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സീക്വൻസും ഹോമോലോഗസാണ്, അതിനാൽ പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ചെയ്യുമ്പോൾ, ആംപ്ലിഫൈഡ് പിസിആർ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ നോൺ-പർപ്പസ്ഫുൾ സീക്വൻസുകളാണ്.ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് വളരെ ചെറുതാണ് അല്ലെങ്കിൽ പ്രൈമർ വളരെ ചെറുതാണ്, അത് തെറ്റായ പോസിറ്റീവിന് സാധ്യതയുണ്ട്.പുനർരൂപകൽപ്പന ചെയ്യണം.

ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് അല്ലെങ്കിൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ക്രോസ് മലിനീകരണം: ഈ മലിനീകരണത്തിന് രണ്ട് കാരണങ്ങളുണ്ട്: ഒന്നാമതായി, മുഴുവൻ ജീനോമിന്റെയും അല്ലെങ്കിൽ വലിയ സെഗ്‌മെന്റുകളുടെയും ക്രോസ്-മലിനീകരണം, തെറ്റായ പോസിറ്റീവുകളിലേക്ക് നയിക്കുന്നു.ഇത്തരത്തിലുള്ള തെറ്റായ പോസിറ്റീവ് ഇനിപ്പറയുന്ന രീതികളിലൂടെ പരിഹരിക്കാൻ കഴിയും: സാമ്പിൾ തോക്കിലേക്ക് ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് ശ്വസിക്കുന്നത് തടയാൻ അല്ലെങ്കിൽ അപകേന്ദ്ര ട്യൂബിൽ നിന്ന് തെറിക്കുന്നത് തടയാൻ ഓപ്പറേഷൻ സമയത്ത് ശ്രദ്ധയും സൗമ്യതയും പുലർത്തുക.ഉയർന്ന താപനിലയെ നേരിടാൻ കഴിയാത്ത എൻസൈമുകളും പദാർത്ഥങ്ങളും ഒഴികെ, എല്ലാ ഘടകങ്ങളും ഉപകരണങ്ങളും ഉയർന്ന മർദ്ദം ഉപയോഗിച്ച് അണുവിമുക്തമാക്കണം.അപകേന്ദ്ര പൈപ്പുകളും സാമ്പിളുകളും ഒരു സമയം ഉപയോഗിക്കണം.ആവശ്യമുള്ളപ്പോൾ, സാമ്പിളുകൾ ചേർക്കുന്നതിനുമുമ്പ്, നിലവിലുള്ള ന്യൂക്ലിക് ആസിഡിനെ നശിപ്പിക്കുന്നതിന് പ്രതികരണ ട്യൂബും റിയാക്ടറും അൾട്രാവയലറ്റ് രശ്മികളിലേക്ക് തുറന്നുകാട്ടുന്നു.രണ്ടാമതായി, വായു മലിനീകരണത്തിൽ ചെറിയ ശകലങ്ങൾ.ഈ ചെറിയ ശകലങ്ങൾ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസിനേക്കാൾ ചെറുതാണ്, പക്ഷേ അവയ്ക്ക് ചില ഹോമോോളജി ഉണ്ട്.ഇത് പരസ്പരം പിളർത്താം.പ്രൈമറുകൾ പൂർത്തീകരിച്ച ശേഷം, PCR ഉൽപ്പന്നം വിപുലീകരിക്കാൻ കഴിയും, ഇത് തെറ്റായ പോസിറ്റീവ് ഉൽപ്പാദനത്തിന് കാരണമാകും.നെസ്റ്റ് പിസിആർ രീതി കുറയ്ക്കാനോ ഇല്ലാതാക്കാനോ ഇത് ഉപയോഗിക്കാം.

● നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡ് ദൃശ്യമാകുന്നു

പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനുശേഷം പ്രത്യക്ഷപ്പെട്ട ബാൻഡുകൾ, പ്രതീക്ഷിച്ച വലുപ്പമോ വലുതോ ചെറുതോ, അല്ലെങ്കിൽ അതേ സമയം, അല്ലെങ്കിൽ അതേ സമയം, നിർദ്ദിഷ്ട ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡുകളും നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡുകളുമായും പൊരുത്തപ്പെടുന്നില്ല.നോൺ-സ്പെസിഫിക് ബാൻഡുകളുടെ ആവിർഭാവം ഇതാണ്: ഒന്നാമതായി, പ്രൈമറുകൾ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസിനോട് അപൂർണ്ണമായ പൂരകമാണ്, അല്ലെങ്കിൽ ഒരു ഡൈ ക്ലസ്റ്റർ രൂപപ്പെടുത്തുന്നതിന് പ്രൈമറിന്റെ പോളിമറൈസേഷൻ.രണ്ടാമത്തേത്, MG2+ അയോണുകളുടെ സാന്ദ്രത വളരെ കൂടുതലാണ്, അനീലിംഗ് താപനില വളരെ കുറവാണ്, കൂടാതെ PCR സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.രണ്ടാമതായി, എൻസൈമുകളുടെ ഗുണനിലവാരവും അളവും.പലപ്പോഴും, ചില സ്രോതസ്സുകളുടെ എൻസൈമുകൾ നോൺ-സ്പെഷ്യൽ ബാൻഡുകൾക്ക് സാധ്യതയുണ്ട്, മറ്റ് ഉറവിടങ്ങളുടെ എൻസൈമുകൾ ഉണ്ടാകില്ല.ചിലപ്പോൾ എൻസൈമുകളുടെ നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും സംഭവിക്കുന്നു.പ്രതിവിധികൾ ഇവയാണ്: ആവശ്യമെങ്കിൽ ആകർഷകമായവ പുനർരൂപകൽപ്പന ചെയ്യുക.എൻസൈമിന്റെ അളവ് കുറയ്ക്കുക അല്ലെങ്കിൽ മറ്റൊരു ഉറവിടത്തിന്റെ എൻസൈം മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുക.പ്രാഥമിക തുക കുറയ്ക്കുക, ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെ അളവ് ഉചിതമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുക, സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം കുറയ്ക്കുക.അനീലിംഗ് താപനില ശരിയായി വർദ്ധിപ്പിക്കുക അല്ലെങ്കിൽ രണ്ട് ടെമ്പറേച്ചർ പോയിന്റ് രീതി ഉപയോഗിക്കുക (93 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ് ഡീജനറേഷൻ, അനിയലിംഗ്, ഏകദേശം 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ നീട്ടൽ).

● ഫ്ലാക്കി ടവ് അല്ലെങ്കിൽ സ്മിയർ ടേപ്പ് ദൃശ്യമാകുന്നു

PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ചിലപ്പോൾ പ്രയോഗിച്ചതോ ഷെൽ ചെയ്തതോ പരവതാനി പോലുള്ള ബെൽറ്റുള്ളതോ ആയി കാണപ്പെടുന്നു.കാരണം, എൻസൈമുകളുടെ അമിതമായ അളവ് അല്ലെങ്കിൽ എൻസൈമിന്റെ മോശം ഗുണനിലവാരം കാരണം, dNTP സാന്ദ്രത വളരെ കൂടുതലാണ്, Mg2+ സാന്ദ്രത വളരെ കൂടുതലാണ്, അനീലിംഗ് താപനില വളരെ കുറവാണ്, കൂടാതെ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം വളരെ കൂടുതലാണ്.പ്രതിരോധ നടപടികൾ ഇവയാണ്: ①എൻസൈമുകളുടെ അളവ് കുറയ്ക്കുക, അല്ലെങ്കിൽ മറ്റൊരു ഉറവിടത്തിന്റെ എൻസൈം മാറ്റുക.②dNTP യുടെ സാന്ദ്രത കുറയ്ക്കുക ③Mg2+ കോൺസൺട്രേഷൻ ശരിയായി കുറയ്ക്കുക.④ ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെ അളവ് കൂട്ടുകയും സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്യുക.

ബന്ധപ്പെട്ട ഉല്പന്നങ്ങൾ

PCR Heroᴹ (ഡൈ ഉപയോഗിച്ച്)

◮ ഉയർന്ന വിശ്വസ്തത: സാധാരണ ടാക്ക് എൻസൈമിന്റെ 6 മടങ്ങ്;

◮ വേഗതയേറിയ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വേഗത

◮ കൂടുതൽ ടെംപ്ലേറ്റ് പൊരുത്തപ്പെടുത്തൽ

◮ ഉയർന്ന ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത

◮ പാരിസ്ഥിതിക സഹിഷ്ണുത കൂടുതൽ ശക്തമാണ്: 37°C താപനിലയിൽ ഒരാഴ്‌ചയ്‌ക്ക് 90%-ത്തിലധികം പ്രവർത്തനം നിലനിർത്തുന്നു;

◮ ഇതിന് 5'→3' ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനവും 3'→5' എക്‌സോന്യൂക്ലീസ് ആക്‌റ്റിവിറ്റി കൂടാതെ 5'→3' എക്‌സോന്യൂക്ലീസ് പ്രവർത്തനവുമുണ്ട്.

പിസിആർ ഈസി (ഡൈ ഉപയോഗിച്ച്)

അദ്വിതീയ പ്രതികരണ സംവിധാനവും ഉയർന്ന കാര്യക്ഷമതയുള്ള ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസും പിസിആർ പ്രതികരണത്തിന് ഉയർന്ന ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയും പ്രത്യേകതയും സംവേദനക്ഷമതയും നൽകുന്നു.

RT-qPCR Easyᴹ (ഒരു ഘട്ടം)-SYBR ഗ്രീൻ I

◮ വൺ-സ്റ്റെപ്പ് കിറ്റ് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും qPCR-ഉം ഒരേ ട്യൂബിൽ രണ്ട് പ്രതികരണങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കുന്നു, ടെംപ്ലേറ്റ് RNA, നിർദ്ദിഷ്ട PCR പ്രൈമറുകൾ, RNase-Free ddH എന്നിവ മാത്രം ചേർക്കേണ്ടതുണ്ട്₂O.

◮ വൈറൽ ആർഎൻഎയെ വേഗത്തിലും കാര്യക്ഷമമായും അളവനുസരിച്ച് വിശകലനം ചെയ്യാനോ ആർഎൻഎ കണ്ടെത്താനോ കിറ്റിന് കഴിയും.

◮ പ്രതികരണത്തിന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയും പ്രത്യേകതയും ഫലപ്രദമായി മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനായി കിറ്റ് ഒരു അദ്വിതീയ ഫോർജീൻ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിയാജന്റും ഫോർജീൻ ഹോട്ട്സ്റ്റാർ ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസും ഒരു അദ്വിതീയ പ്രതികരണ സംവിധാനവും ഉപയോഗിക്കുന്നു.

◮ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത പ്രതികരണ സംവിധാനം പ്രതികരണത്തിന് ഉയർന്ന ഡിറ്റക്ഷൻ സെൻസിറ്റിവിറ്റി, ശക്തമായ താപ സ്ഥിരത, മികച്ച സഹിഷ്ണുത എന്നിവ ഉണ്ടാക്കുന്നു.

◮ RT-qPCR എളുപ്പമാണ്^TM(ഒരു ഘട്ടം)-SYBR ഗ്രീൻ I കിറ്റിൽ ROX ഇന്റേണൽ റഫറൻസ് ഡൈ വരുന്നു, ഇത് സിഗ്നൽ പശ്ചാത്തലവും കിണറുകൾക്കിടയിലുള്ള സിഗ്നൽ പിശകുകളും ഇല്ലാതാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കാം, ഇത് ഉപഭോക്താക്കൾക്ക് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR ഉപകരണങ്ങളുടെ വ്യത്യസ്ത മോഡലുകളിൽ ഉപയോഗിക്കാൻ സൗകര്യപ്രദമാണ്.

RT ഈസി^TMII (ഇതിനായുള്ള മാസ്റ്റർ പ്രീമിക്സ് ആദ്യ സ്ട്രാൻഡ് cDNA സിന്തസിസ്തത്സമയ പിസിആർ)

-2 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ടെംപ്ലേറ്റിലെ gDNA നീക്കം ചെയ്യാൻ കഴിയുന്ന gDNA നീക്കം ചെയ്യാനുള്ള കാര്യക്ഷമമായ കഴിവ്.

- കാര്യക്ഷമമായ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സിസ്റ്റം, ആദ്യ സ്ട്രാൻഡ് cDNA യുടെ സമന്വയം പൂർത്തിയാക്കാൻ 15 മിനിറ്റ് മാത്രമേ എടുക്കൂ.

-സങ്കീർണ്ണമായ ടെംപ്ലേറ്റുകൾ: ഉയർന്ന ജിസി ഉള്ളടക്കവും സങ്കീർണ്ണമായ ദ്വിതീയ ഘടനയും ഉള്ള ടെംപ്ലേറ്റുകളും ഉയർന്ന കാര്യക്ഷമതയോടെ വിപരീതമാക്കാവുന്നതാണ്.

ഹൈ-സെൻസിറ്റിവിറ്റി റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സിസ്റ്റം, pg-ലെവൽ ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്കും ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള cDNA ലഭിക്കും.

റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സിസ്റ്റത്തിന് ഉയർന്ന താപ സ്ഥിരതയുണ്ട്, ഒപ്റ്റിമൽ റിയാക്ഷൻ താപനില 42℃ ആണ്, കൂടാതെ ഇതിന് ഇപ്പോഴും 50℃-ൽ മികച്ച റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രകടനമുണ്ട്.