തന്മാത്രാ ജീവശാസ്ത്രത്തിന്റെ അടിസ്ഥാന പരീക്ഷണമാണ് RT-qPCR, എല്ലാവർക്കും അത് പരിചിതമായിരിക്കണം.ഇതിൽ പ്രധാനമായും മൂന്ന് ഘട്ടങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്നു: ആർഎൻഎ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ, സിഡിഎൻഎയിലേക്കുള്ള റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ, തത്സമയ ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ.ഇത് സഹായിക്കില്ല, എന്താണ് സംഭവിക്കുന്നത്?അതിൽ ഒരു പ്രശ്നമുണ്ടാകാൻ സാധ്യതയുണ്ട്റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പരീക്ഷണം!റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പരീക്ഷണത്തിന് RNA, dNTP, പ്രൈമറുകൾ, കൂടാതെറിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിലേക്ക് നന്നായി ഇളക്കുക, എന്നാൽ യഥാർത്ഥ പ്രവർത്തന പ്രക്രിയയിൽ, ശ്രദ്ധിക്കേണ്ട നിരവധി വിശദാംശങ്ങൾ ഇപ്പോഴും ഉണ്ട്.നമുക്ക് അതിനെക്കുറിച്ച് പഠിക്കാം!

ആർഎൻഎയുടെ ഗുണനിലവാരം എങ്ങനെ വിലയിരുത്താം?
സിഡിഎൻഎ ലഭിക്കുന്നതിന്, ആർഎൻഎയുടെ ഗുണനിലവാരം നിർണായകമാണ്!ആർഎൻഎ ഗുണനിലവാരം പ്രധാനമായും രണ്ട് വശങ്ങളിൽ നിന്ന് കണ്ടെത്താനാകും:
(1) ആർഎൻഎ സമഗ്രത:അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് വഴി ആർഎൻഎ സമഗ്രത പരിശോധിക്കാം. യൂക്കറിയോട്ടുകൾ ഉദാഹരണമായി എടുത്താൽ, പൂർണ്ണമായ ആർഎൻഎയ്ക്ക് മൂന്ന് വ്യക്തമായ ബാൻഡുകളുണ്ട്, വലുത് മുതൽ ചെറുത് വരെയുള്ള തന്മാത്രാ ഭാരം 28S, 18S, 5S എന്നിവയാണ്, കൂടാതെ 28S 18S-ന്റെ ഇരട്ടി തെളിച്ചമുള്ളതാണ്;മൂന്ന് ബാൻഡുകൾ കാണാൻ കഴിയുമെങ്കിൽ, എന്നാൽ ബാൻഡ് തരം മങ്ങിക്കുകയാണെങ്കിൽ അല്ലെങ്കിൽ ഡിഫ്യൂഷൻ എന്നാൽ ആർഎൻഎ ഭാഗികമായി നശിക്കുന്നു എന്നാണ്.ഈ സമയത്ത്, ദയവായി റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രതികരണം ഉടനടി നടത്തുകയും ഉചിതമായ രീതിയിൽ ടെംപ്ലേറ്റ് ഇൻപുട്ട് വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുക;ഒരു ചെറിയ തന്മാത്രാ ഭാരമോ ബാൻഡ് ഇല്ലാത്തതോ ആയ ഒരു ബാൻഡ് മാത്രമേ കാണാനാകൂ എങ്കിൽ, ആർഎൻഎ പൂർണ്ണമായും ഡീഗ്രേഡായതിനാൽ വീണ്ടും വേർതിരിച്ചെടുക്കേണ്ടതുണ്ട്.എജിലന്റ് 2100, പീക്ക് ഡയഗ്രാമും RIN മൂല്യവും ഉള്ള RNA യുടെ സമഗ്രതയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് കേടുകൂടാതെയിരിക്കുകയാണെങ്കിൽ, ഇലക്ട്രോഫെറോഗ്രാമിന്റെ അടിസ്ഥാനരേഖ പരന്നതാണ്;ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഗുരുതരമായി ജീർണിച്ചാൽ, അടിസ്ഥാനം അസമമാണ്, കൂടുതൽ നാശത്തിന്റെ കൊടുമുടികൾ പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നു;RIN ന്റെ മൂല്യം RNA യുടെ സമഗ്രതയെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു, 0-10 പരിധിക്കുള്ളിൽ, വലിയ മൂല്യം, RNA യുടെ ഗുണനിലവാരം മെച്ചപ്പെടും.ശരി, സമ്പൂർണ്ണതയുടെ ഉയർന്ന ബിരുദം.
(2) ആർഎൻഎയുടെ പരിശുദ്ധി:OD260/280 ന്റെ അനുപാതം UV സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമെട്രി വഴി കണ്ടെത്താനാകും.OD260/280 ന്റെ അനുപാതം 1.9 നും 2.1 നും ഇടയിലാണെങ്കിൽ, ശുദ്ധി വളരെ നല്ലതാണ്.
ശേഷിക്കുന്ന ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ കൃത്യമായ അളവിലുള്ള ഫലങ്ങളിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം
ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കുമ്പോൾ, നമുക്ക് ലഭിക്കുന്ന ആർഎൻഎ ശുദ്ധീകരിക്കപ്പെടാത്ത ജനിതക ഡിഎൻഎയുമായി (ജിഡിഎൻഎ) കലർന്നേക്കാം.അതിനാൽ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനു ശേഷമുള്ള സിഡിഎൻഎയും മിക്സ് ചെയ്യപ്പെടുംgDNA.താഴത്തെ സമയത്ത്qPCRപ്രതികരണം,cDNAഒപ്പം gDNA യും ഒരേസമയം വർദ്ധിപ്പിച്ചേക്കാം, ഇത് താരതമ്യേന ചെറിയ CT മൂല്യത്തിന് കാരണമാകുന്നു, അതിനാൽ ഫലങ്ങൾ പക്ഷപാതപരമായിരിക്കാം.
അപ്പോൾ ഈ സാഹചര്യത്തിൽ നമ്മൾ എന്താണ് ചെയ്യേണ്ടത്?ഫോറിൻനിർദ്ദേശിക്കുന്നു:
(1) റിവേഴ്‌സ്ഡ് ആർഎൻഎയിൽ ജീനോം ക്ലീനിംഗ് നടത്തുക, ആർഎൻഎ എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷൻ സമയത്ത് കോളം എക്‌സ്‌ട്രാക്‌ഷൻ വഴി നീക്കം ചെയ്യാം;
(2) വേർതിരിച്ചെടുത്ത RNAയെ DNase ഉപയോഗിച്ച് കൈകാര്യം ചെയ്യുകI , എന്നാൽ EDTA ഉപയോഗിച്ച് അത് അവസാനിപ്പിക്കുക;
റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിയാക്ടറുകളുടെജീനോം ക്ലിയറിംഗ് മൊഡ്യൂളുകൾക്കൊപ്പം;

റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനായി പ്രൈമറുകൾ എങ്ങനെ തിരഞ്ഞെടുക്കാം?
റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രൈമറുകൾ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രതികരണത്തിന്റെ ഫലത്തെയും ബാധിക്കുന്നു.പരീക്ഷണത്തിന്റെ പ്രത്യേക സാഹചര്യങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനായി നിങ്ങൾക്ക് റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ, ഒലിഗോ ഡിടി അല്ലെങ്കിൽ ജീൻ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കാം:
(1) നിർദ്ദിഷ്ട ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ: ജീൻ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു;
(2) നീണ്ട ശകലം ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ: Oligo dT/ജീൻ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു;
(3) ലോംഗ്-സെഗ്മെന്റ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെ ആന്തരിക ശകലങ്ങൾ: ജീൻ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ/ റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ / റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ + ഒലിഗോ ഡിടി.തുടർന്നുള്ള qPCR പരീക്ഷണം നടത്തുകയാണെങ്കിൽ, Oligo dT ഒറ്റയ്ക്ക് ഉപയോഗിക്കാൻ കഴിയില്ല, കാരണം Oligo dT മാത്രം ഉപയോഗിക്കുന്നത് 3′ അന്തിമ പക്ഷപാതത്തിന് കാരണമായേക്കാം, ഇത് കൃത്യമല്ലാത്ത qPCR പരീക്ഷണ ഫലങ്ങളിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം;
(4) miRNA: സ്റ്റെം-ലൂപ്പ് പ്രൈമറുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ടെയ്ലിംഗ് പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കാം.

റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഉൽപ്പന്നം cDNA എത്ര തവണ ലയിപ്പിക്കണം?
റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ cDNA ലഭിച്ച ശേഷം, qPCR പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി cDNA എത്ര തവണ നേർപ്പിക്കണം എന്നത് വളരെ പ്രധാനമാണ്.cDNA കോൺസൺട്രേഷൻ വളരെ കൂടുതലോ കുറവോ ആണെങ്കിൽ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയെ ബാധിച്ചേക്കാം.cDNA കോൺസൺട്രേഷൻ അളക്കാൻ കഴിയുമോ, അത് എങ്ങനെ ചെയ്യണം?
(1) റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ cDNA കോൺസൺട്രേഷൻ അളക്കാൻ കഴിയില്ല, കാരണം cDNA ഉൽപ്പന്നത്തിന് പുറമേ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഉൽപ്പന്നത്തിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ശേഷിക്കുന്ന ബഫർ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ, പ്രൈമറുകൾ മുതലായവയും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, ഇത് ഏകാഗ്രത അളക്കൽ ഫലങ്ങളെ തടസ്സപ്പെടുത്തുകയും OD/280,260/280260-ന് കാരണമാകില്ല. യഥാർത്ഥ cDNA വിളവ് പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു.ഈ സമയത്ത്, ചില സുഹൃത്തുക്കൾ പറയും, ശുദ്ധീകരണത്തിന് ശേഷം ഞാൻ ഏകാഗ്രത അളക്കും;ഇവിടെ, സിഡിഎൻഎ ശുദ്ധീകരിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്തിട്ടില്ലെന്ന് ഫോർജീൻ ഓർമ്മിപ്പിക്കാൻ ആഗ്രഹിക്കുന്നു, കാരണം റിവേഴ്സൽ വഴി ലഭിച്ച സിഡിഎൻഎയുടെ നീളം വ്യത്യസ്തമാണ്, കൂടാതെ ശുദ്ധീകരണത്തിൽ ഹ്രസ്വമായ സിഡിഎൻഎ നഷ്ടപ്പെടും.
(2) അപ്പോൾ എന്താണ് ചെയ്യേണ്ടത്?qPCR പരീക്ഷണത്തിന് മുമ്പ്, പ്രീ-പരീക്ഷണത്തിലൂടെ cDNA യുടെ ഡൈല്യൂഷൻ ഗ്രേഡിയന്റ് നിർണ്ണയിക്കാനാകും.ഉദാഹരണത്തിന്: cDNA സ്റ്റോക്ക് സൊല്യൂഷൻ, 10 ​​മടങ്ങ് നേർപ്പിക്കൽ, 100 മടങ്ങ് നേർപ്പിക്കൽ എന്നിവ qPCR പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി ടെംപ്ലേറ്റുകളായി ഉപയോഗിക്കുക, കൂടാതെ 18-28 പരിധിയിലുള്ള CT മൂല്യമുള്ള ഡില്യൂഷൻ ഫാക്ടർ തിരഞ്ഞെടുക്കുക.

മൈആർഎൻഎകൾ എങ്ങനെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്യണം?
പ്രോട്ടീനിനായി കോഡ് ചെയ്യാത്ത ഏകദേശം 22 nt വലിപ്പമുള്ള ഒരു ഒറ്റ-ധാരയുള്ള ചെറിയ തന്മാത്ര RNA ആണ് miRNA.ദൈർഘ്യം കുറവായതിനാൽ, പരമ്പരാഗത qPCR രീതി നേരിട്ട് അളക്കാൻ പ്രയാസമാണ്, അതിനാൽ പലപ്പോഴും miRNA നീട്ടേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്;miRNA യ്‌ക്കായി സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന റിവേഴ്‌സ് ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്ഷൻ രീതികളിൽ സ്റ്റെം-ലൂപ്പ് രീതിയും ടെയ്‌ലിംഗ് രീതിയും ഉൾപ്പെടുന്നു.
സ്റ്റെം-ലൂപ്പ് പ്രൈമറുകൾ ചേർത്ത് മൈആർഎൻഎ നീട്ടുന്നതാണ് സ്റ്റെം-ലൂപ്പ് രീതി.ഈ കണ്ടെത്തൽ രീതിക്ക് ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമതയും പ്രത്യേകതയുമുണ്ട്, എന്നാൽ കണ്ടെത്തൽ ത്രൂപുട്ട് കുറവാണ്.ഒരു റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന് ഒരു മൈആർഎൻഎയും ഒരു ആന്തരിക റഫറൻസും മാത്രമേ കണ്ടെത്താൻ കഴിയൂ;രണ്ട് എൻസൈമുകളുടെ സംയുക്ത പ്രവർത്തനത്തിലൂടെയാണ് വാൽ ചേർക്കൽ രീതി പൂർത്തീകരിക്കുന്നത്, പോളിഎ പോളിമറേസും റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റസും ആണ്.MiRNA യുടെ നീളം കൂട്ടുന്നതിനായി PolyA വാലുകൾ ചേർക്കുന്നതിന് PolyA പോളിമറേസ് ഉത്തരവാദിയാണ്, കൂടാതെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിയാക്ഷൻ നടത്തുന്നു.ഈ രീതിക്ക് ഉയർന്ന ഡിറ്റക്ഷൻ ത്രൂപുട്ട് ഉണ്ട്, ഒന്നിലധികം മൈആർഎൻഎകളും ആന്തരിക റഫറൻസുകളും ഒരു റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനിൽ കണ്ടെത്താനാകും, എന്നാൽ സ്റ്റെം-ലൂപ്പ് രീതിയിൽ സെൻസിറ്റിവിറ്റിയും പ്രത്യേകതയും കുറവാണ്.