റിയൽ ടൈം PCR, ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR അല്ലെങ്കിൽ qPCR എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു, PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ തത്സമയ നിരീക്ഷണത്തിനും വിശകലനത്തിനുമുള്ള ഒരു രീതിയാണ്.
ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR-ന് ലളിതമായ പ്രവർത്തനം, വേഗമേറിയതും സൗകര്യപ്രദവുമായ, ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമത, നല്ല ആവർത്തനക്ഷമത, കുറഞ്ഞ മലിനീകരണ നിരക്ക് എന്നിവയുടെ ഗുണങ്ങൾ ഉള്ളതിനാൽ, മെഡിക്കൽ പരിശോധന, മയക്കുമരുന്ന് ഫലപ്രാപ്തി വിലയിരുത്തൽ, ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ ഗവേഷണം, ട്രാൻസ്ജെനിക് ഗവേഷണം, ജീൻ കണ്ടെത്തൽ, രോഗകാരി കണ്ടെത്തൽ, മൃഗങ്ങളെയും സസ്യങ്ങളെയും കണ്ടെത്തൽ എന്നിവയിൽ ഇത് വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു., ഭക്ഷ്യ പരിശോധനയും മറ്റ് മേഖലകളും.
അതിനാൽ, നിങ്ങൾ ലൈഫ് സയൻസസിലെ അടിസ്ഥാന ഗവേഷണത്തിലോ ഫാർമസ്യൂട്ടിക്കൽ കമ്പനികളിലോ മൃഗസംരക്ഷണ കമ്പനികളിലോ ഭക്ഷ്യ കമ്പനികളിലോ എൻട്രി എക്സിറ്റ് ഇൻസ്പെക്ഷൻ, ക്വാറന്റൈൻ ബ്യൂറോകൾ, പരിസ്ഥിതി നിരീക്ഷണ വകുപ്പുകൾ, ആശുപത്രികൾ, മറ്റ് യൂണിറ്റുകൾ എന്നിവയിലെ ജീവനക്കാരോ ആണെങ്കിലും, നിങ്ങൾ കൂടുതലോ കുറവോ എക്സ്പോഷർ ചെയ്യും അല്ലെങ്കിൽ പിസിആർ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് അറിവ് അറിഞ്ഞിരിക്കണം.

തത്സമയ പിസിആറിന്റെ തത്വം

റിയൽ ടൈം പിസിആർ എന്നത് പിസിആർ റിയാക്ഷൻ സിസ്റ്റത്തിലേക്ക് ഫ്ലൂറസെന്റ് പദാർത്ഥങ്ങൾ ചേർക്കുന്ന ഒരു രീതിയാണ്, കൂടാതെ പിസിആർ പ്രതികരണ പ്രക്രിയയിലെ ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നൽ തീവ്രത ഒരു ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ ഉപകരണം തത്സമയം നിരീക്ഷിക്കുകയും ഒടുവിൽ പരീക്ഷണാത്മക ഡാറ്റ വിശകലനം ചെയ്യുകയും പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു.

【ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ്】PCR-ന്റെ ചലനാത്മക പ്രക്രിയയെ വിവരിക്കുന്ന വക്രമാണ്.പിസിആറിന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ് യഥാർത്ഥത്തിൽ ഒരു സാധാരണ എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ കർവ് അല്ല, മറിച്ച് ഒരു സിഗ്‌മോയിഡ് കർവ് ആണ്.

[ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവിന്റെ പ്ലാറ്റ്ഫോം ഘട്ടം]പിസിആർ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണത്തിൽ വർദ്ധനവ്, ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെ നിഷ്ക്രിയത്വം, ഡിഎൻടിപികളുടെയും പ്രൈമറുകളുടെയും ശോഷണം, ബൈ-പ്രൊഡക്റ്റ് പൈറോഫോസ്ഫേറ്റ് മുതലായവയിലൂടെ സിന്തസിസ് പ്രതിപ്രവർത്തനത്തെ തടയുന്നു., ഒടുവിൽ ഒരു പീഠഭൂമിയിൽ പ്രവേശിക്കും.

[ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവിന്റെ എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ഗ്രോത്ത് റീജിയൻ]പീഠഭൂമി ഘട്ടം വളരെ വ്യത്യസ്തമാണെങ്കിലും, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവിന്റെ എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ഗ്രോത്ത് റീജിയന്റെ ഒരു പ്രത്യേക മേഖലയിൽ, ആവർത്തനക്ഷമത വളരെ നല്ലതാണ്, ഇത് പിസിആറിന്റെ അളവ് വിശകലനത്തിന് വളരെ പ്രധാനമാണ്.

[ത്രെഷോൾഡ് മൂല്യവും Ct മൂല്യവും]ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവിന്റെ എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ഗ്രോത്ത് ഏരിയയിലെ ഉചിതമായ സ്ഥാനത്ത് ഞങ്ങൾ ഫ്ലൂറസെൻസ് കണ്ടെത്തലിന്റെ പരിധി മൂല്യം സജ്ജീകരിച്ചു, അതായത് ത്രെഷോൾഡ് മൂല്യം (ത്രെഷോൾഡ്).ത്രെഷോൾഡ് മൂല്യത്തിന്റെയും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വക്രത്തിന്റെയും വിഭജനം Ct മൂല്യമാണ്, അതായത്, പരിധി മൂല്യം എത്തുമ്പോൾ Ct മൂല്യം സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണത്തെ (ത്രെഷോൾഡ് സൈക്കിൾ) സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

താഴെയുള്ള ഗ്രാഫ് ത്രെഷോൾഡ് ലൈനും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ്, ത്രെഷോൾഡ്, സിടി മൂല്യം എന്നിവ തമ്മിലുള്ള ബന്ധം വ്യക്തമായി കാണിക്കുന്നു.

【എങ്ങനെ കണക്കാക്കാം?】

പ്രാരംഭ ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെ എണ്ണത്തിന്റെ ലോഗരിതവുമായി Ct മൂല്യത്തിന് വിപരീത രേഖീയ ബന്ധമുണ്ടെന്ന് ഗണിതശാസ്ത്ര സിദ്ധാന്തം തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്.റിയൽ ടൈം പിസിആർ പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ തത്സമയം നിരീക്ഷിക്കുകയും എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഘട്ടത്തിൽ അവയെ അളക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.

പിസിആറിന്റെ ഓരോ ചക്രത്തിനും, ഡിഎൻഎ 2 മടങ്ങ് വർധിച്ചു, താമസിയാതെ ഒരു പീഠഭൂമിയിലെത്തി.

ഡിഎൻഎ ആരംഭിക്കുന്നതിന്റെ അളവ് എ ആണെന്ന് കരുതുക₀ , n സൈക്കിളുകൾക്ക് ശേഷം, ഡിഎൻഎ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ സൈദ്ധാന്തിക അളവ് ഇങ്ങനെ പ്രകടിപ്പിക്കാം:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

തുടർന്ന്, പ്രാരംഭ ഡിഎൻഎ തുക A 0 ആണെങ്കിൽ, ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ അളവ് എത്രയും വേഗം കണ്ടെത്തൽ മൂല്യത്തിൽ എത്തുന്നു, കൂടാതെ An-ൽ എത്തുമ്പോൾ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം Ct മൂല്യമാണ്.അതായത്, പ്രാരംഭ ഡിഎൻഎ തുക A 0 കൂടുന്തോറും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ് ഉയർന്നുവരുന്നു, അതിനനുസരിച്ച് ആവശ്യമായ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം n ചെറുതായിരിക്കും.

ഞങ്ങൾ അറിയപ്പെടുന്ന ഏകാഗ്രതയുടെ നിലവാരത്തിന്റെ ഗ്രേഡിയന്റ് ഡൈല്യൂഷൻ നടത്തുകയും അത് റിയൽ ടൈം PCR-നുള്ള ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, ഡിഎൻഎ തുക കൂടുതലിൽ നിന്ന് കുറവിലേക്ക് ആരംഭിക്കുന്ന ക്രമത്തിൽ തുല്യ ഇടവേളകളിൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവുകളുടെ ഒരു ശ്രേണി ലഭിക്കും.Ct മൂല്യവും ആരംഭിക്കുന്ന ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെ എണ്ണത്തിന്റെ ലോഗരിതം തമ്മിലുള്ള രേഖീയ ബന്ധം അനുസരിച്ച്, a[സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ്] സൃഷ്ടിക്കാൻ കഴിയും.

സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവിലേക്ക് അജ്ഞാത സാന്ദ്രതയുള്ള സാമ്പിളിന്റെ Ct മൂല്യം മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്നതിലൂടെ, അജ്ഞാത ഏകാഗ്രതയുള്ള സാമ്പിളിന്റെ പ്രാരംഭ ടെംപ്ലേറ്റ് തുക ലഭിക്കും, ഇത് തത്സമയ PCR-ന്റെ അളവ് തത്വമാണ്.

റിയൽ ടൈം PCR-ന്റെ കണ്ടെത്തൽ രീതി

റിയാക്ഷൻ സിസ്റ്റത്തിലെ ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത കണ്ടെത്തി പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ റിയൽ ടൈം പിസിആർ കണ്ടെത്തുന്നു.

ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈ എംബെഡിംഗ് രീതിയുടെ തത്വം】

ഫ്ലൂറസെന്റ് ചായങ്ങൾ, ടിബി ഗ്രീൻ ® പോലെ, പിസിആർ സിസ്റ്റങ്ങളിലെ ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎയുമായി പ്രത്യേകമായി ബന്ധിപ്പിക്കാനും ബന്ധിപ്പിക്കുമ്പോൾ ഫ്ലൂറസുചെയ്യാനും കഴിയും.

പിസിആർ സൈക്കിളുകളുടെ വർദ്ധനവോടെ പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിലെ ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത ക്രമാതീതമായി വർദ്ധിച്ചു.ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത കണ്ടെത്തുന്നതിലൂടെ, പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിലെ ഡിഎൻഎ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ അളവ് തത്സമയം നിരീക്ഷിക്കാൻ കഴിയും, തുടർന്ന് സാമ്പിളിലെ ആരംഭ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ അളവ് വിപരീതമായി കണക്കാക്കാം.

【ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബ് രീതിയുടെ തത്വം】

ഫ്ലൂറസെന്റ് അന്വേഷണം5′ അറ്റത്ത് ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പും 3′ അറ്റത്ത് ഒരു ക്വഞ്ചിംഗ് ഗ്രൂപ്പും ഉള്ള ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് സീക്വൻസാണ്, ഇത് ടെംപ്ലേറ്റുമായി പ്രത്യേകമായി ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.അന്വേഷണം കേടുകൂടാതെയിരിക്കുമ്പോൾ, ഫ്ലൂറോഫോർ പുറപ്പെടുവിക്കുന്ന ഫ്ലൂറസെൻസ് കെടുത്തുന്ന ഗ്രൂപ്പിനാൽ ശമിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു, മാത്രമല്ല ഫ്ലൂറസ് ചെയ്യാൻ കഴിയില്ല.അന്വേഷണം വിഘടിപ്പിക്കുമ്പോൾ, ഫ്ലൂറസെന്റ് പദാർത്ഥം വിഘടിക്കുകയും ഫ്ലൂറസെൻസ് പുറപ്പെടുവിക്കുകയും ചെയ്യും.

പിസിആർ പ്രതികരണ പരിഹാരത്തിലേക്ക് ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് അന്വേഷണം ചേർത്തിരിക്കുന്നു.അനീലിംഗ് പ്രക്രിയയിൽ, ഫ്ലൂറസെന്റ് അന്വേഷണം ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ നിർദ്ദിഷ്ട സ്ഥാനവുമായി ബന്ധിപ്പിക്കും.വിപുലീകരണ പ്രക്രിയയിൽ, പിസിആർ എൻസൈമിന്റെ 5′→3′ എക്സോന്യൂക്ലീസ് പ്രവർത്തനത്തിന് ടെംപ്ലേറ്റുമായി സങ്കരമാക്കിയ ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബിനെ വിഘടിപ്പിക്കാൻ കഴിയും, കൂടാതെ ഫ്ലൂറസെന്റ് പദാർത്ഥം ഫ്ലൂറസെൻസ് പുറപ്പെടുവിക്കാൻ വിഘടിപ്പിക്കുന്നു.പ്രതിപ്രവർത്തന സംവിധാനത്തിലെ അന്വേഷണത്തിന്റെ ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത കണ്ടെത്തുന്നതിലൂടെ, പിസിആർ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ അളവ് നിരീക്ഷിക്കുന്നതിനുള്ള ഉദ്ദേശ്യം കൈവരിക്കാനാകും.

【ഫ്ലൂറസെൻസ് കണ്ടെത്തൽ രീതിയുടെ തിരഞ്ഞെടുപ്പ്】

ഉയർന്ന ഹോമോളജി ഉപയോഗിച്ച് സീക്വൻസുകളെ വേർതിരിച്ചറിയാനും എസ്എൻപി ടൈപ്പിംഗ് അനാലിസിസ് പോലുള്ള മൾട്ടിപ്ലക്സ് പിസിആർ ഡിറ്റക്ഷൻ നടത്താനും ഇത് ഉപയോഗിക്കുന്നുവെങ്കിൽ, ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബ് രീതി പകരം വയ്ക്കാൻ കഴിയില്ല.
മറ്റ് തത്സമയ PCR പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക്, ലളിതവും എളുപ്പമുള്ളതും ചെലവ് കുറഞ്ഞതുമായ ഫ്ലൂറസെന്റ് ചിമേറ രീതി ഉപയോഗിക്കാം.

മൾട്ടിപ്ലക്‌സ് PCR-ന്റെ കഴിവുള്ള ശക്തമായ പ്രത്യേകത

പോരായ്മ

ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി ഉയർന്ന നിർദ്ദിഷ്ട ആവശ്യകതകൾ;

മൾട്ടിപ്ലക്‌സ് പിസിആർ നടത്താൻ കഴിയില്ല, പ്രത്യേക പ്രോബുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യേണ്ടതുണ്ട്, ഉയർന്ന വില;

ചിലപ്പോൾ പ്രോബ് ഡിസൈൻ ബുദ്ധിമുട്ടാണ്

ബന്ധപ്പെട്ട ഉല്പന്നങ്ങൾ: