ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR-ന്റെ ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട ഫല അവതരണ രൂപമാണ് Ct മൂല്യം.ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വ്യത്യാസങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ ജീൻ കോപ്പി നമ്പർ കണക്കാക്കാൻ ഇത് ഉപയോഗിക്കുന്നു.അപ്പോൾ ഫ്ലൂറസെൻസ് ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷന്റെ Ct മൂല്യം ന്യായമായി കണക്കാക്കുന്നത് എന്താണ്?Ct മൂല്യത്തിന്റെ ഫലപ്രദമായ ശ്രേണി എങ്ങനെ ഉറപ്പാക്കാം?

എന്താണ് Ct മൂല്യം?
qPCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രക്രിയയിൽ, ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നൽ സെറ്റ് ഫ്ലൂറസെൻസ് ത്രെഷോൾഡിൽ എത്തുമ്പോൾ, അനുബന്ധ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം (സൈക്കിൾ ത്രെഷോൾഡ്).C എന്നാൽ സൈക്കിളും T എന്നാൽ ത്രെഷോൾഡും ആണ്.ലളിതമായി പറഞ്ഞാൽ, പ്രാരംഭ ടെംപ്ലേറ്റ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ qPCR-ൽ ഒരു നിശ്ചിത അളവിലുള്ള ഉൽപ്പന്നത്തിൽ എത്തുമ്പോൾ ബന്ധപ്പെട്ട സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണമാണ് Ct മൂല്യം."ഒരു നിശ്ചിത അളവിലുള്ള ഉൽപ്പന്നം" എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്നത് പിന്നീട് കൂടുതൽ വിശദീകരിക്കും.

Ct മൂല്യം എന്താണ് ചെയ്യുന്നത്?

1. എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ, ടെംപ്ലേറ്റ് തുക, Ct മൂല്യം എന്നിവ തമ്മിലുള്ള ബന്ധം
ഒരു നിശ്ചിത എണ്ണം സൈക്കിളുകൾക്ക് ശേഷം എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വഴിയാണ് qPCR-ലെ ജീനുകൾ ശേഖരിക്കപ്പെടുന്നത്.ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണവും ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ അളവും തമ്മിലുള്ള ബന്ധം ഇതാണ്: ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്ന തുക = പ്രാരംഭ ടെംപ്ലേറ്റ് തുക × (1+En) സൈക്കിൾ നമ്പർ.എന്നിരുന്നാലും, qPCR പ്രതികരണം എല്ലായ്പ്പോഴും അനുയോജ്യമായ അവസ്ഥയിലല്ല.ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ അളവ് ഒരു "ചില ഉൽപ്പന്ന തുക" എത്തുമ്പോൾ, ഈ സമയത്തെ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം Ct മൂല്യമാണ്, അത് എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാലയളവിലാണ്.Ct മൂല്യവും ആരംഭിക്കുന്ന ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ അളവും തമ്മിലുള്ള ബന്ധം: ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ Ct മൂല്യവും ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ ആരംഭ കോപ്പി നമ്പറിന്റെ ലോഗരിതവും തമ്മിൽ ഒരു രേഖീയ ബന്ധമുണ്ട്.പ്രാരംഭ ടെംപ്ലേറ്റ് കോൺസൺട്രേഷൻ കൂടുന്തോറും Ct മൂല്യം ചെറുതാണ്;പ്രാരംഭ ടെംപ്ലേറ്റ് സാന്ദ്രത കുറയുമ്പോൾ, Ct മൂല്യം വലുതായിരിക്കും.

2.ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ്, ഫ്ലൂറസെൻസ് ത്രെഷോൾഡ്, നിശ്ചിത പിസിആർ ഉൽപ്പന്ന തുക
qPCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ അളവ് നേരിട്ട് ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലിന്റെ രൂപത്തിൽ അവതരിപ്പിക്കുന്നു, അതായത്, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ്.പിസിആറിന്റെ പ്രാരംഭ ഘട്ടത്തിൽ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ അനുയോജ്യമായ അവസ്ഥയിലാണ്, സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം ചെറുതാണ്, ഉൽപ്പന്ന ശേഖരണം ചെറുതാണ്, ഫ്ലൂറസെൻസ് പശ്ചാത്തലത്തിൽ നിന്ന് ഫ്ലൂറസെൻസിന്റെ അളവ് വ്യക്തമായി വേർതിരിച്ചറിയാൻ കഴിയില്ല.അതിനുശേഷം, ഫ്ലൂറസെൻസ് വർദ്ധിക്കുകയും എക്സ്പോണൻഷ്യൽ ഘട്ടത്തിലേക്ക് പ്രവേശിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.പിസിആർ പ്രതികരണം എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ഘട്ടത്തിലായിരിക്കുമ്പോൾ ഒരു നിശ്ചിത ഘട്ടത്തിൽ പിസിആർ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ അളവ് കണ്ടെത്താനാകും, അത് “ഒരു നിശ്ചിത അളവിലുള്ള ഉൽപ്പന്നമായി” ഉപയോഗിക്കാം, കൂടാതെ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ പ്രാരംഭ ഉള്ളടക്കം ഇതിൽ നിന്ന് കണക്കാക്കാം.അതിനാൽ, ഒരു നിശ്ചിത അളവിലുള്ള ഉൽപ്പന്നവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നൽ തീവ്രത ഫ്ലൂറസെൻസ് പരിധിയാണ്.

പിസിആറിന്റെ അവസാന ഘട്ടത്തിൽ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വക്രം എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാണിക്കില്ല, കൂടാതെ ലീനിയർ ഫേസിലേക്കും പീഠഭൂമി ഘട്ടത്തിലേക്കും പ്രവേശിക്കുന്നു.

3.Ct മൂല്യങ്ങളുടെ പുനരുൽപാദനക്ഷമത
PCR സൈക്കിൾ Ct മൂല്യത്തിന്റെ സൈക്കിൾ നമ്പറിൽ എത്തുമ്പോൾ, അത് യഥാർത്ഥ എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാലയളവിലേക്ക് പ്രവേശിച്ചു.ഈ സമയത്ത്, ചെറിയ പിശക് വർദ്ധിപ്പിച്ചിട്ടില്ല, അതിനാൽ Ct മൂല്യത്തിന്റെ പുനരുൽപാദനക്ഷമത മികച്ചതാണ്, അതായത്, ഒരേ ടെംപ്ലേറ്റ് വ്യത്യസ്ത സമയങ്ങളിൽ അല്ലെങ്കിൽ വ്യത്യസ്ത ട്യൂബുകളിൽ ഒരേ സമയം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു.ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ, ലഭിച്ച Ct മൂല്യം സ്ഥിരമാണ്.

1. ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത En
പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത എന്നത് പോളിമറേസ് ജീനിനെ ആംപ്ലിക്കൺ ആക്കി മാറ്റുന്ന കാര്യക്ഷമതയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഒരു ഡിഎൻഎ തന്മാത്രയെ രണ്ട് ഡിഎൻഎ തന്മാത്രകളാക്കി മാറ്റുമ്പോൾ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത 100% ആണ്.ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത സാധാരണയായി En ആയി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു.തുടർന്നുള്ള ലേഖനങ്ങളുടെ വിശകലനം സുഗമമാക്കുന്നതിന്, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയെ ബാധിക്കുന്ന ഘടകങ്ങൾ ഹ്രസ്വമായി അവതരിപ്പിക്കുന്നു.

2.Ct മൂല്യങ്ങളുടെ ശ്രേണി
Ct മൂല്യങ്ങൾ 15-35 വരെയാണ്.Ct മൂല്യം 15-ൽ കുറവാണെങ്കിൽ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ അടിസ്ഥാന കാലയളവിന്റെ പരിധിക്കുള്ളിലാണെന്നും ഫ്ലൂറസെൻസ് ത്രെഷോൾഡിൽ എത്തിയിട്ടില്ലെന്നും കണക്കാക്കുന്നു.മികച്ച രീതിയിൽ, Ct മൂല്യവും ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ പ്രാരംഭ കോപ്പി നമ്പറിന്റെ ലോഗരിതം, അതായത് സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് എന്നിവ തമ്മിൽ ഒരു രേഖീയ ബന്ധമുണ്ട്.സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് വഴി, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത 100% ആയിരിക്കുമ്പോൾ, ജീനിന്റെ സിംഗിൾ കോപ്പി നമ്പർ കണക്കാക്കുന്നതിനുള്ള Ct മൂല്യം ഏകദേശം 35 ആണ്. ഇത് 35-ൽ കൂടുതലാണെങ്കിൽ, ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ പ്രാരംഭ പകർപ്പ് നമ്പർ 1-ൽ താഴെയാണ്, അത് അർത്ഥശൂന്യമായി കണക്കാക്കാം.

വ്യത്യസ്ത ജീൻ Ct ശ്രേണികൾക്കായി, ജീൻ കോപ്പി നമ്പറിലെ വ്യത്യാസവും പ്രാരംഭ ടെംപ്ലേറ്റ് തുകയിലെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയും കാരണം, ജീനിനായി ഒരു സാധാരണ വക്രം ഉണ്ടാക്കുകയും ജീനിന്റെ ലീനിയർ ഡിറ്റക്ഷൻ ശ്രേണി കണക്കാക്കുകയും ചെയ്യേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്.

3.Ct മൂല്യത്തെ സ്വാധീനിക്കുന്ന ഘടകങ്ങൾ
ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണവും ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ അളവും തമ്മിലുള്ള ബന്ധത്തിൽ നിന്ന്: ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ അളവ് = പ്രാരംഭ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ അളവ് × (1+En) സൈക്കിൾ നമ്പറിന്റെ അളവ്, അനുയോജ്യമായ സാഹചര്യങ്ങളിൽ, പ്രാരംഭ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെയും En ന്റെയും അളവ് Ct മൂല്യത്തെ പ്രതികൂലമായി ബാധിക്കുമെന്ന് കാണാൻ കഴിയും.ടെംപ്ലേറ്റ് ഗുണനിലവാരത്തിലോ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയിലോ ഉള്ള വ്യത്യാസം Ct മൂല്യം വളരെ വലുതോ ചെറുതോ ആകാൻ ഇടയാക്കും.

4.Ct മൂല്യം വളരെ വലുതാണ് അല്ലെങ്കിൽ വളരെ ചെറുതാണ്