qPCR പരീക്ഷണങ്ങളിൽ, പ്രൈമർ ഡിസൈൻ വളരെ പ്രധാനപ്പെട്ട ഒരു ലിങ്കാണ്.പ്രൈമറുകൾ അനുയോജ്യമാണോ അല്ലയോ എന്നത് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത നിലവാരത്തിൽ എത്തുന്നുണ്ടോ, ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ നിർദ്ദിഷ്ടമാണോ, പരീക്ഷണ ഫലങ്ങൾ ലഭ്യമാണോ എന്നിവയുമായി അടുത്ത ബന്ധമുണ്ട്.
അപ്പോൾ എങ്ങനെ qPCR പ്രൈമർ സ്പെസിസിറ്റി മികച്ചതാക്കാം?ഉയർന്ന ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത?
ഇന്ന്, qPCR പ്രൈമറുകൾ ഒരുമിച്ച് രൂപകൽപ്പന ചെയ്യാൻ ഞങ്ങൾ നിങ്ങളെ കൊണ്ടുപോകും, ​​കൂടാതെ qPCR പ്രൈമർ ഡിസൈൻ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ കാര്യക്ഷമമായ ഒരു ലോർ വൈദഗ്ധ്യമായി മാറട്ടെ.
qPCR പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുമ്പോൾ, സാധാരണയായി ഇനിപ്പറയുന്ന പോയിന്റുകൾ ശ്രദ്ധിക്കുക: പ്രൈമറുകൾ കഴിയുന്നത്ര ഇൻട്രോണുകളിലുടനീളം രൂപകൽപ്പന ചെയ്യണം, ഉൽപ്പന്ന ദൈർഘ്യം 100-300 bp ആയിരിക്കണം, Tm മൂല്യം 60 ° C വരെ ആയിരിക്കണം, കൂടാതെ അപ്‌സ്ട്രീം, ഡൗൺസ്ട്രീം പ്രൈമറുകൾ കഴിയുന്നത്ര അടുത്ത് ആയിരിക്കണം, കൂടാതെ പ്രൈമറിന്റെ അവസാനം G അല്ലെങ്കിൽ C ആയിരിക്കണം.
1. ഇൻട്രോണുകൾ വ്യാപിക്കുന്ന പ്രൈമറുകളുടെ രൂപകൽപ്പന
qPCR പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുമ്പോൾ, ഇൻട്രോണുകളിലുടനീളം രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത പ്രൈമറുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നത് gDNA ടെംപ്ലേറ്റ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിൽ നിന്ന് തടയും, കൂടാതെ ഉൽപ്പന്നങ്ങളെല്ലാം cDNA-യുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞതാണ്, അങ്ങനെ gDNA മലിനീകരണത്തിന്റെ സ്വാധീനം ഇല്ലാതാക്കുന്നു.
2. പ്രൈമർ നീളം
പ്രൈമർ ദൈർഘ്യം സാധാരണയായി 18-30 nt നും ഇടയിലാണ്, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ ദൈർഘ്യം കഴിയുന്നത്ര 100-300 bp വരെ നിയന്ത്രിക്കണം.
പ്രൈമർ വളരെ ചെറുതാണെങ്കിൽ, അത് നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷനിലേക്ക് നയിക്കും, അത് വളരെ ദൈർഘ്യമേറിയതാണെങ്കിൽ, അത് എളുപ്പത്തിൽ ദ്വിതീയ ഘടന (ഹെയർപിൻ ഘടന പോലുള്ളവ) രൂപീകരിക്കും.ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നം വളരെ ദൈർഘ്യമേറിയതാണെങ്കിൽ, അത് പോളിമറേസിന്റെ പ്രതികരണത്തിന് അനുയോജ്യമല്ല, ഇത് PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ കാര്യക്ഷമതയെ ബാധിക്കും.
3. GC ഉള്ളടക്കവും Tm മൂല്യവും
പ്രൈമറുകളുടെ GC ഉള്ളടക്കം 40% മുതൽ 60% വരെ നിയന്ത്രിക്കണം.ഇത് വളരെ ഉയർന്നതോ വളരെ കുറവോ ആണെങ്കിൽ, അത് പ്രതികരണം ആരംഭിക്കുന്നതിന് അനുയോജ്യമല്ല.ഒരേ Tm മൂല്യവും അനീലിംഗ് താപനിലയും ലഭിക്കുന്നതിന് ഫോർവേഡ്, റിവേഴ്സ് പ്രൈമറുകളുടെ GC ഉള്ളടക്കം സമാനമായിരിക്കണം.
Tm മൂല്യം കഴിയുന്നത്ര 55-65°C നും ഇടയിൽ ആയിരിക്കണം, സാധാരണയായി ഏകദേശം 60°C ആയിരിക്കണം, കൂടാതെ അപ്‌സ്ട്രീമിന്റെയും ഡൗൺസ്ട്രീമിന്റെയും Tm മൂല്യം കഴിയുന്നത്ര അടുത്തായിരിക്കണം, വെയിലത്ത് 4°C-ൽ കൂടരുത്.
4. പ്രൈമറിന്റെ 3′ അറ്റത്ത് A തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നത് ഒഴിവാക്കുക
പ്രൈമറിന്റെ 3′ അറ്റം പൊരുത്തപ്പെടാത്തപ്പോൾ, വ്യത്യസ്ത അടിത്തറകളുടെ സിന്തസിസ് കാര്യക്ഷമതയിൽ വലിയ വ്യത്യാസങ്ങളുണ്ട്.അവസാന ബേസ് എ ആയിരിക്കുമ്പോൾ, പൊരുത്തക്കേടിന്റെ കാര്യത്തിൽ പോലും ഇതിന് ചെയിൻ സിന്തസിസ് ആരംഭിക്കാൻ കഴിയും, കൂടാതെ അവസാന ബേസ് ടി എപ്പോൾ , പൊരുത്തക്കേട് ഇൻഡക്ഷന്റെ കാര്യക്ഷമത വളരെ കുറയുന്നു.അതിനാൽ, പ്രൈമറിന്റെ 3′ അറ്റത്ത് എ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നത് ഒഴിവാക്കാൻ ശ്രമിക്കുക, ടി തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.
ഇതൊരു പ്രോബ് പ്രൈമർ ആണെങ്കിൽ, അന്വേഷണത്തിന്റെ 5′ അവസാനം G ആകാൻ കഴിയില്ല, കാരണം ഒരൊറ്റ G ബേസ് FAM ഫ്ലൂറസെന്റ് റിപ്പോർട്ടർ ഗ്രൂപ്പുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുമ്പോൾ പോലും, FAM ഗ്രൂപ്പ് പുറപ്പെടുവിക്കുന്ന ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലിനെ കെടുത്താനും G-യ്ക്ക് കഴിയും, ഇത് തെറ്റായ നെഗറ്റീവ് ഫലങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കുന്നു.പ്രത്യക്ഷപ്പെടുക.
5. അടിസ്ഥാന വിതരണം
പ്രൈമറിലെ നാല് ബേസുകളുടെ വിതരണം ക്രമരഹിതമാണ്, 3′ അറ്റത്ത് തുടർച്ചയായി 3-ൽ കൂടുതൽ G അല്ലെങ്കിൽ C ഒഴിവാക്കുകയും തുടർച്ചയായി 3-ൽ കൂടുതൽജിസി-റിച്ച് സീക്വൻസ് റീജിയനിൽ ജോടിയാക്കാൻ ജി അല്ലെങ്കിൽ സി എളുപ്പമാണ്.
6. പ്രൈമർ ഡിസൈൻ മേഖല സങ്കീർണ്ണമായ ദ്വിതീയ ഘടനകൾ ഒഴിവാക്കണം.
ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ സിംഗിൾ സ്‌ട്രാൻഡ് രൂപീകരിച്ച ദ്വിതീയ ഘടന പിസിആറിന്റെ സുഗമമായ പുരോഗതിയെ ബാധിക്കും.ലക്ഷ്യ ശ്രേണിയിൽ ഒരു ദ്വിതീയ ഘടനയുണ്ടോ എന്ന് മുൻകൂട്ടി പ്രവചിക്കുന്നതിലൂടെ, പ്രൈമറുകളുടെ രൂപകൽപ്പനയിൽ ഈ പ്രദേശം ഒഴിവാക്കാൻ ശ്രമിക്കുക.
7. പ്രൈമറുകൾ തന്നെയും പ്രൈമറുകൾക്കിടയിലും തുടർച്ചയായ പൂരക അടിത്തറകൾ ഒഴിവാക്കാൻ ശ്രമിക്കണം.
പ്രൈമറിനും പ്രൈമറിനും ഇടയിൽ തുടർച്ചയായി 4 അടിസ്ഥാന പൂരകങ്ങൾ ഉണ്ടാകരുത്.പ്രൈമറിന് തന്നെ ഒരു കോംപ്ലിമെന്ററി സീക്വൻസ് ഉണ്ടാകരുത്, അല്ലാത്തപക്ഷം അത് ഒരു ഹെയർപിൻ ഘടന രൂപപ്പെടുത്തുന്നതിന് സ്വയം മടക്കിക്കളയും, ഇത് പ്രൈമറിന്റെയും ടെംപ്ലേറ്റിന്റെയും അനീലിംഗ് കോമ്പിനേഷനെ ബാധിക്കും.
അപ്‌സ്ട്രീം, ഡൗൺസ്ട്രീം പ്രൈമറുകൾക്കിടയിൽ കോംപ്ലിമെന്ററി സീക്വൻസുകൾ നിലനിൽക്കില്ല.പ്രൈമറുകൾ തമ്മിലുള്ള പരസ്പര പൂരകത പ്രൈമർ ഡൈമറുകൾ നിർമ്മിക്കും, ഇത് പിസിആർ കാര്യക്ഷമത കുറയ്ക്കുകയും അളവ് കൃത്യതയെ ബാധിക്കുകയും ചെയ്യും.പ്രൈമർ-ഡൈമർ, ഹെയർപിൻ ഘടനകൾ എന്നിവ ഒഴിവാക്കാനാവാത്തതാണെങ്കിൽ, △G മൂല്യം വളരെ ഉയർന്നതായിരിക്കരുത് (4.5 kcal/mol-ൽ കുറവായിരിക്കണം).
8. പ്രൈമറുകൾ ടാർഗെറ്റ് നിർദ്ദിഷ്ട ഉൽപ്പന്നം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു.
ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ സമൃദ്ധി മനസ്സിലാക്കുക എന്നതാണ് qPCR കണ്ടെത്തലിന്റെ ആത്യന്തിക ലക്ഷ്യം.നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സംഭവിക്കുകയാണെങ്കിൽ, അളവ് കൃത്യമല്ല.അതിനാൽ, പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത ശേഷം, അവ BLAST ഉപയോഗിച്ച് പരിശോധിക്കേണ്ടതുണ്ട്, കൂടാതെ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ പ്രത്യേകത സീക്വൻസ് ഡാറ്റാബേസിൽ താരതമ്യം ചെയ്യുന്നു.
അടുത്തതായി, qPCR പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുന്നതിനുള്ള ഒരു ഉദാഹരണമായി ഞങ്ങൾ മനുഷ്യ GAS6 (ഗ്രോത്ത് അറസ്റ്റ് നിർദ്ദിഷ്ട 6) ജീൻ എടുക്കുന്നു.
01 അന്വേഷണ ജീൻ
ഹോമോ GAS6എൻസിബിഐ വഴി.ഇവിടെ, ജീൻ നാമവും സ്പീഷീസുകളും സ്ഥിരതയുള്ളതാണെന്ന് ഉറപ്പാക്കാൻ താരതമ്യം ചെയ്യാൻ നാം ശ്രദ്ധിക്കണം.
02 ജീൻ സീക്വൻസ് കണ്ടെത്തുക
(1) ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ ആണെങ്കിൽ, ആദ്യത്തേത് തിരഞ്ഞെടുക്കുക, അത് ജീനിന്റെ ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ സീക്വൻസാണ്.
(2) ലക്ഷ്യം mRNA ആണെങ്കിൽ, രണ്ടാമത്തേത് തിരഞ്ഞെടുക്കുക.നൽകിയ ശേഷം, ചുവടെയുള്ള പട്ടികയിൽ "CDS" ക്ലിക്ക് ചെയ്യുക.ജീനിന്റെ കോഡിംഗ് സീക്വൻസാണ് ബ്രൗൺ ബാക്ക്ഗ്രൗണ്ട് സീക്വൻസ്.
03 ഡിസൈൻ പ്രൈമറുകൾ
പ്രൈമർ-ബ്ലാസ്റ്റ് ഇന്റർഫേസ് നൽകുക
മുകളിൽ ഇടതുവശത്തുള്ള ഫാസ്റ്റ ഫോർമാറ്റിൽ ജീൻ സീക്വൻസ് നമ്പർ അല്ലെങ്കിൽ സീക്വൻസ് നൽകുക, തുടർന്ന് പ്രസക്തമായ പാരാമീറ്ററുകൾ പൂരിപ്പിക്കുക.

“പ്രൈമറുകൾ നേടുക” ക്ലിക്കുചെയ്യുക, അത്തരം പാരാമീറ്റർ തിരഞ്ഞെടുക്കൽ മറ്റ് സ്‌പ്ലിംഗ് വേരിയന്റുകളിലേക്ക് വർദ്ധിപ്പിക്കുമെന്ന് നിങ്ങളോട് പറയാൻ NCBI പോപ്പ് അപ്പ് ചെയ്യും.നമുക്ക് വ്യത്യസ്‌ത സ്‌പ്ലിക്കിംഗ് വേരിയന്റുകൾ പരിശോധിച്ച് ഉചിതമായ പ്രൈമർ ജോടി ലഭിക്കുന്നതിന് അവ സമർപ്പിക്കാം (ചുവടെയുള്ള ചിത്രത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നത് പോലെ).ഈ പ്രക്രിയ പ്രവർത്തിക്കാൻ പതിനായിരക്കണക്കിന് സെക്കൻഡുകൾ എടുത്തേക്കാം.
ഈ പ്രൈമർ ജോഡികളുടെ അനീലിംഗ് താപനില ഏകദേശം 60 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസാണ്.പരീക്ഷണത്തിന്റെ ഉദ്ദേശ്യമനുസരിച്ച്, പരീക്ഷണത്തിനായി പ്രൈമറുകളുടെ മിതമായ നീളവും നല്ല പ്രത്യേകതയും കുറഞ്ഞ സ്വയം പൂരകവുമുള്ള പ്രൈമറുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുക, വിജയ നിരക്ക് വളരെ ഉയർന്നതാണ്!
04പ്രൈമർ സ്‌പെസിസിറ്റി വെരിഫിക്കേഷൻ
വാസ്തവത്തിൽ, പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുന്നതിനൊപ്പം, പ്രൈമർ-ബ്ലാസ്റ്റിന് ഞങ്ങൾ സ്വയം രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത പ്രൈമറുകളെ വിലയിരുത്താനും കഴിയും.പ്രൈമർ ഡിസൈൻ പേജിലേക്ക് മടങ്ങുക, ഞങ്ങൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത അപ്‌സ്ട്രീം, ഡൗൺസ്ട്രീം പ്രൈമറുകൾ നൽകുക, മറ്റ് പാരാമീറ്ററുകൾ ക്രമീകരിക്കില്ല.സമർപ്പിച്ച ശേഷം, ജോഡി പ്രൈമറുകൾ മറ്റ് ജീനുകളിലും ഉണ്ടോ എന്ന് നിങ്ങൾക്ക് കാണാൻ കഴിയും.അവയെല്ലാം നമ്മൾ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ ആഗ്രഹിക്കുന്ന ജീനിൽ പ്രദർശിപ്പിച്ചാൽ, ഈ ജോഡി പ്രൈമറുകളുടെ പ്രത്യേകത മികച്ചതാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു!(ഉദാഹരണത്തിന്, പ്രൈമർ അന്വേഷണത്തിന്റെ ഒരേയൊരു ഫലം ഇതാണ്!)

05 പ്രൈമർ ഗുണനിലവാര വിധി
"ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത സ്റ്റാൻഡേർഡ് വരെ", "ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്ന സവിശേഷതകൾ", "വിശ്വസനീയമായ പരീക്ഷണ ഫലങ്ങൾ" എന്നിവ സംയോജിപ്പിക്കുന്ന "തികഞ്ഞ" പ്രൈമർ ഏത് തരത്തിലുള്ള പ്രൈമർ ആണ്?
ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത

ഉരുകുന്ന വക്രം
പ്രൈമറുകളുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത 90%-110% വരെ എത്തുന്നു, അതിനർത്ഥം ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത നല്ലതാണെന്നും ഉരുകൽ വളവിന് ഒരൊറ്റ കൊടുമുടിയും സാധാരണയായി Tm>80 ° C ഉം ഉണ്ട്, അതായത് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രത്യേകത നല്ലതാണ്.
 
ബന്ധപ്പെട്ട ഉല്പന്നങ്ങൾ:
റിയൽ ടൈം പിസിആർ ഈസി–സിബിആർ ഗ്രീൻ ഐ
തത്സമയ പിസിആർ ഈസി-തഖ്മാൻ