ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് എക്‌സ്‌ട്രാക്‌ഷൻ ഇല്ലാതെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി മൃഗങ്ങളുടെയോ ചെടികളുടെയോ കോശങ്ങളെ നേരിട്ട് ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു പ്രതികരണമാണ് ഡയറക്ട് പിസിആർ.പല തരത്തിൽ, നേരിട്ടുള്ള PCR സാധാരണ PCR പോലെ പ്രവർത്തിക്കുന്നു

നേരിട്ടുള്ള പിസിആറിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഇഷ്‌ടാനുസൃത ബഫറാണ് പ്രധാന വ്യത്യാസം, ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷൻ ഇല്ലാതെ സാമ്പിൾ നേരിട്ട് പിസിആർ പ്രതികരണത്തിന് വിധേയമാക്കാം, പക്ഷേ എൻസൈമുകളുടെ സഹിഷ്ണുതയ്ക്കും നേരിട്ടുള്ള പിസിആർ പ്രതികരണത്തിൽ ഉൾപ്പെടുന്ന ബഫറിന്റെ അനുയോജ്യതയ്ക്കും അനുബന്ധ ആവശ്യകതകളുണ്ട്.

സാധാരണ സാമ്പിളുകളിൽ കൂടുതലോ കുറവോ പിസിആർ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ഉണ്ടെങ്കിലും, എൻസൈമുകളുടെയും ബഫറുകളുടെയും പ്രവർത്തനത്തിൽ നേരിട്ടുള്ള പിസിആർ ഇപ്പോഴും വിശ്വസനീയമായ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ നേടാൻ കഴിയും.പരമ്പരാഗത PCR പ്രതികരണത്തിന് ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ആവശ്യമാണ്, ഇത് ടെംപ്ലേറ്റിൽ പ്രോട്ടീനുകളും മറ്റ് മാലിന്യങ്ങളും അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെങ്കിൽ PCR പ്രതികരണത്തിന്റെ സുഗമമായ പുരോഗതിയെ തടയാൻ കഴിയും.ഡയറക്ട് പിസിആർ നിലവിൽ മോളിക്യുലാർ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക്സ് മേഖലയിലെ ഏറ്റവും ജനപ്രിയമായ സാങ്കേതികവിദ്യകളിൽ ഒന്നാണ്.

01 ഡയറക്ട് പിസിആർ യഥാർത്ഥത്തിൽ മൃഗങ്ങൾക്കും സസ്യങ്ങൾക്കും ഉപയോഗിച്ചിരുന്നു

നേരിട്ടുള്ള PCR-ന്റെ ആദ്യകാല പ്രയോഗം മൃഗങ്ങളുടെയും സസ്യങ്ങളുടെയും മേഖലയിലാണ്, അതായത് എലി, പൂച്ച, കോഴി, മുയൽ, ആട്, കന്നുകാലി എന്നിവയുടെ രക്തം, കോശങ്ങൾ, കന്നുകാലികൾ, ചെടിയുടെ ഇലകൾ, വിത്തുകൾ മുതലായവ, ജനിതകമാറ്റം, ട്രാൻസ്ജെനിക്, പ്ലാസ്മിഡ് ഡിറ്റക്ഷൻ, ജീൻ നോക്കൗട്ട് വിശകലനം, ഡിഎൻഎ ഉറവിടം തിരിച്ചറിയൽ, മറ്റ് ഫീൽഡ് തിരിച്ചറിയൽ, ഫീൽഡ് തിരിച്ചറിയൽ.

ഈ ഫീൽഡുകൾക്ക് ചില പൊതുവായ സവിശേഷതകളുണ്ട്, അതായത്, ടാർഗെറ്റ് ജീൻ ഉള്ളടക്കം താരതമ്യേന ഉയർന്നതും ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ ബുദ്ധിമുട്ടുള്ളതുമാണ്, അതിനാൽ നേരിട്ടുള്ള പിസിആറിന് സമയം ലാഭിക്കാനും ഫലങ്ങളിൽ ചെറിയ സ്വാധീനം ചെലുത്താനും മാത്രമല്ല, ചിലവ് ലാഭിക്കാനും കഴിയും.

രോഗകാരികളെ കണ്ടെത്തുന്നതിന് നേരിട്ടുള്ള പിസിആർ ഉപയോഗിക്കുന്നത് സമീപ വർഷങ്ങളിലെ കാര്യമാണ്, നവീകരണം നടത്തുമ്പോൾ ചില പിസിആർ റിയാജന്റ് നിർമ്മാതാക്കൾ ഈ ദിശയിൽ വളരെയധികം പരിശ്രമിച്ചിട്ടുണ്ട്.പ്രത്യേകിച്ചും ഈ COVID-19 പകർച്ചവ്യാധിയിൽ, SARS-CoV-2 ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഡിറ്റക്ഷൻ കിറ്റ് (മൾട്ടിപ്ലക്സ് PCR ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബ് മെത്തേഡ്) പോലുള്ള നിരവധി ഡിറ്റക്ഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ വിപണിയിൽ പ്രത്യക്ഷപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, ഇത് Foregene ഗവേഷണം ചെയ്ത് വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു, ഇത് മനുഷ്യത്വ ന്യൂക്ലിക് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെ തത്സമയ RT PCR സാങ്കേതികവിദ്യ (rRT-PCR) ഉപയോഗിക്കുന്നു. അല്ലെങ്കിൽ ഓറോഫറിംഗൽ സ്വാബ് സാമ്പിളുകൾ.

സാധാരണ ORF1ab, N, E, എന്നിവ കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഡയറക്ട് PCR സാങ്കേതികവിദ്യ ഉപയോഗിക്കുന്ന കമ്പനികളിൽ ഒന്നാണ് Foregene.വേരിയന്റ് SARS-CoV-2 B.1.1.7 ലൈനേജ് (യുകെ), B.1.351 ലൈനേജ് (ZA), B.1.617 ലൈനേജ് (IND), P.1 ലൈനേജ് (BR) തുടങ്ങിയ മനുഷ്യ നാസോഫറിംഗൽ അല്ലെങ്കിൽ ഓറോഫറിൻജിയൽ സ്വാബ് സാമ്പിളുകളിലെ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾ.

02  നേരിട്ടുള്ള പിസിആറിന് ആവശ്യമായ റിയാഗന്റുകൾ

സാമ്പിൾ ലൈസേറ്റ്

സാമ്പിൾ ലൈസേറ്റ് സ്വയം ക്രമീകരിക്കുകയോ വാങ്ങുകയോ ചെയ്യാം.ലൈസറ്റിന്റെ വ്യത്യസ്ത ബ്രാൻഡുകളുടെ ഘടനയിലെ വ്യത്യാസം ലൈസിംഗ് കഴിവ് വ്യത്യസ്തമാക്കും, തുടർന്ന് ലൈസിംഗ് സമയം അല്പം വ്യത്യസ്തമായിരിക്കും.ഉദാഹരണത്തിന്, മൃഗങ്ങളുടെ ടിഷ്യു സാമ്പിളുകൾ തയ്യാറാക്കുന്നതിന്, 30 മിനിറ്റ് അല്ലെങ്കിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ലിസിസ് സാധാരണയായി ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു, കൂടാതെ വൈറസുകൾക്കുള്ള ലിസിസ് പരിഹാരം 3-10 മിനിറ്റ് വരെയാണ്.

പിസിആർ മാസ്റ്റർ മിക്സ്

നിർദ്ദിഷ്ട ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ശേഷി വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും ഹോട്ട്-സ്റ്റാർട്ട് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.നേരിട്ടുള്ള പിസിആറിന്റെ കാതൽ വളരെ സഹിഷ്ണുതയുള്ള പോളിമറേസാണ്.

ഡിഎൻഎ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനെ ബാധിക്കുന്ന സാമ്പിളിലെ ഘടകങ്ങൾ ഇല്ലാതാക്കുക അല്ലെങ്കിൽ തടയുക

ലൈസേറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിൾ പ്രോസസ്സ് ചെയ്ത ശേഷം, പ്രോട്ടീനുകൾ, ലിപിഡുകൾ, മറ്റ് കോശ അവശിഷ്ടങ്ങൾ എന്നിവ പുറത്തുവിടും, ഈ പദാർത്ഥങ്ങൾ പിസിആർ പ്രതികരണത്തെ തടയും.അതിനാൽ, നേരിട്ടുള്ള പിസിആറിന് ഈ ഘടകങ്ങളുടെ സ്വാധീനം കുറയ്ക്കുന്നതിന് അനുബന്ധ നീക്കം അല്ലെങ്കിൽ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ചേർക്കേണ്ടതുണ്ട്.

03  നേരിട്ടുള്ള പിസിആറിന്റെ അഞ്ച് വിജ്ഞാന പോയിന്റുകളുടെ ശേഖരം

ഒന്നാമതായി, ഡയറക്ട് പിസിആർ സാങ്കേതികവിദ്യ വിവിധ ജൈവ സാമ്പിളുകൾക്കുള്ള നേരിട്ടുള്ള പിസിആർ സാങ്കേതികവിദ്യയാണ്.ഈ സാങ്കേതിക വ്യവസ്ഥയ്ക്ക് കീഴിൽ, ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വേർതിരിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുക്കേണ്ട ആവശ്യമില്ല, ടിഷ്യു സാമ്പിൾ നേരിട്ട് വസ്തുവായി ഉപയോഗിക്കുക, കൂടാതെ പിസിആർ പ്രതികരണം നടത്താൻ ടാർഗെറ്റ് ജീൻ പ്രൈമറുകൾ ചേർക്കുക.

രണ്ടാമതായി, ഡയറക്ട് പിസിആർ സാങ്കേതികവിദ്യ ഒരു പരമ്പരാഗത ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സാങ്കേതികവിദ്യ മാത്രമല്ല, ആർഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റ് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പിസിആർ ഉൾപ്പെടുന്നു.

മൂന്നാമതായി, ഡയറക്ട് പിസിആർ സാങ്കേതികവിദ്യ ടിഷ്യൂ സാമ്പിളുകളിൽ സാധാരണ ഗുണപരമായ പിസിആർ പ്രതികരണങ്ങൾ നടത്തുക മാത്രമല്ല, തത്സമയ qPCR പ്രതികരണങ്ങളും ഉൾപ്പെടുന്നു, ഇതിന് പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിന് ശക്തമായ പശ്ചാത്തല വിരുദ്ധ ഫ്ലൂറസെൻസ് ഇടപെടൽ ശേഷി ആവശ്യമാണ്, എൻഡോജെനസ് ഫ്ലൂറസെൻസ് ശത്രുതാപരമായ കഴിവിനെ ശമിപ്പിക്കുന്നു.

നാലാമതായി, ഡയറക്ട് പിസിആർ സാങ്കേതികവിദ്യ ലക്ഷ്യമിടുന്ന സാമ്പിളുകൾക്ക് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെ പ്രകാശനം മാത്രമേ ആവശ്യമുള്ളൂ, പിസിആർ പ്രതികരണത്തെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്ന പ്രോട്ടീനുകൾ, പോളിസാക്രറൈഡുകൾ, ഉപ്പ് അയോണുകൾ മുതലായവ നീക്കം ചെയ്യരുത്.സങ്കീർണ്ണമായ സാഹചര്യങ്ങളിൽ എൻസൈം പ്രവർത്തനവും അനുകരണ കൃത്യതയും ഉറപ്പാക്കാൻ മികച്ച പ്രതിരോധവും പൊരുത്തപ്പെടുത്തലും ഉണ്ടായിരിക്കാൻ പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിലെ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് പോളിമറേസും പിസിആർ മിക്സും ആവശ്യമാണ്.

അഞ്ചാമതായി, ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് സമ്പുഷ്ടീകരണ ചികിത്സ കൂടാതെ ഡയറക്ട് പിസിആർ സാങ്കേതികവിദ്യ ഉപയോഗിച്ച് ടിഷ്യു സാമ്പിൾ ടാർഗെറ്റുചെയ്‌തതും ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ അളവും വളരെ ചെറുതാണ്, ഇതിന് പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിന് വളരെ ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമതയും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയും ആവശ്യമാണ്.