പ്രൈമർ ഡിസൈൻ അടിസ്ഥാനം (99% പ്രശ്നങ്ങൾ പരിഹരിക്കാൻ കഴിയും)

1. പ്രൈമർ ദൈർഘ്യം: പാഠപുസ്തകത്തിന് 15-30 ബിപി ആവശ്യമാണ്, സാധാരണയായി ഏകദേശം 20 ബിപി.സ്പെസിഫിറ്റി ഉറപ്പാക്കാൻ യഥാർത്ഥ അവസ്ഥ 18-24 ബിപി ആകുന്നതാണ് നല്ലത്, എന്നാൽ ദൈർഘ്യമേറിയതും വളരെ ദൈർഘ്യമേറിയതുമായ പ്രൈമർ പ്രത്യേകത കുറയ്ക്കുകയും വിളവ് കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്യും.

2. പ്രൈമർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സ്‌പാൻ: 200-500 ബിപി ഉചിതമാണ്, പ്രത്യേക വ്യവസ്ഥകളിൽ ശകലം 10 കെബി വരെ വികസിപ്പിക്കാം.

3. പ്രൈമർ ബേസ്: G+C യുടെ ഉള്ളടക്കം 40-60% ആയിരിക്കണം, വളരെ കുറച്ച് G+C ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഇഫക്റ്റ് നല്ലതല്ല, വളരെയധികം G+C നോൺ-സ്പെസിഫിക് ബാൻഡുകൾ ദൃശ്യമാകാൻ എളുപ്പമാണ്.5-ൽ കൂടുതൽ പ്യൂരിൻ അല്ലെങ്കിൽ പിരിമിഡിൻ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളുടെ ക്ലസ്റ്ററുകൾ ഒഴിവാക്കിക്കൊണ്ട് ATGC ക്രമരഹിതമായി വിതരണം ചെയ്യുന്നതാണ് നല്ലത്.സ്ഥിരത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് 5′ അവസാനത്തിനും ഇന്റർമീഡിയറ്റ് സീക്വൻസുകൾക്കുമുള്ള മൾട്ടി-ജിസി, 3′ അറ്റത്ത് റിച്ച് ജിസി ഒഴിവാക്കുക, അവസാനത്തെ 3 ബേസുകൾക്ക് ജിസി ഇല്ല, അല്ലെങ്കിൽ അവസാനത്തെ 5 ബേസുകളിൽ 3-ന് ജിസി ഇല്ല.

4. പ്രൈമറുകളിൽ ദ്വിതീയ ഘടന ഒഴിവാക്കുക, രണ്ട് പ്രൈമറുകൾ തമ്മിലുള്ള പൂരകങ്ങൾ ഒഴിവാക്കുക, പ്രത്യേകിച്ച് 3 'അവസാനത്തിൽ പൂർത്തീകരണം, അല്ലാത്തപക്ഷം പ്രൈമർ ഡൈമർ രൂപീകരിക്കുകയും നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫൈഡ് ബാൻഡുകൾ സൃഷ്ടിക്കുകയും ചെയ്യും.

5. ജോടിയാക്കാത്ത ടെർമിനൽ ബേസുകൾ കാരണം PCR പരാജയം ഒഴിവാക്കാൻ പ്രൈമറുകളുടെ 3 'അറ്റത്തുള്ള ബേസുകൾ, പ്രത്യേകിച്ച് അവസാനത്തേതും അവസാനത്തേതുമായ ബേസുകൾ, കർശനമായി ജോടിയാക്കണം.

6. പ്രൈമറുകൾക്ക് ഉചിതമായ ക്ലിവേജ് സൈറ്റുകൾ ഉണ്ട് അല്ലെങ്കിൽ ചേർക്കാം, കൂടാതെ ആംപ്ലിഫൈഡ് ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസുകൾക്ക് ഉചിതമായ ക്ലിവേജ് സൈറ്റുകൾ ഉണ്ടായിരിക്കണം, ഇത് ക്ലീവേജ് വിശകലനത്തിനോ തന്മാത്രാ ക്ലോണിംഗിനോ വളരെ പ്രയോജനകരമാണ്.

7. പ്രൈമറുകളുടെ പ്രത്യേകത: ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് സീക്വൻസ് ഡാറ്റാബേസിലെ മറ്റ് സീക്വൻസുകളുമായി പ്രൈമറുകൾക്ക് വ്യക്തമായ ഹോമോളജി ഉണ്ടാകരുത്.

8. സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിക്കാൻ പഠിക്കുക: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (ഈ ഓൺലൈൻ ഡിസൈൻ മികച്ച രീതിയിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്നു).

മുകളിലെ ഉള്ളടക്കത്തിന് പ്രൈമർ ഡിസൈൻ പ്രശ്നങ്ങളിൽ 99% എങ്കിലും പരിഹരിക്കാൻ കഴിയും.

പ്രൈമർ ഡിസൈനിന്റെ വിശദാംശങ്ങൾ നിയന്ത്രിക്കുക

1. പ്രൈമർ നീളം

പൊതുവായ പ്രൈമർ ദൈർഘ്യം 18~30 ബേസുകളാണ്.പൊതുവേ, പ്രൈമറിന്റെ അനീലിംഗ് താപനില നിർണ്ണയിക്കുന്ന ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട ഘടകം പ്രൈമറിന്റെ ദൈർഘ്യമാണ്.പ്രൈമറിന്റെ അനീലിംഗ് താപനില സാധാരണയായി തിരഞ്ഞെടുക്കപ്പെടുന്നു (Tm മൂല്യം -5℃), ചിലർ നേരിട്ട് Tm മൂല്യം ഉപയോഗിക്കുന്നു.പ്രൈമറുകളുടെ അനീലിംഗ് താപനില ഏകദേശം കണക്കാക്കാൻ ഇനിപ്പറയുന്ന ഫോർമുലകൾ ഉപയോഗിക്കാം.

പ്രൈമറിന്റെ ദൈർഘ്യം 20bp-ൽ കുറവായിരിക്കുമ്പോൾ: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃

പ്രൈമറിന്റെ ദൈർഘ്യം 20bp-ൽ കൂടുതലാകുമ്പോൾ: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/ദൈർഘ്യം-5℃

കൂടാതെ, അനീലിംഗ് താപനില കണക്കാക്കാൻ നിരവധി സോഫ്റ്റ്വെയറുകളും ഉപയോഗിക്കാം, കണക്കുകൂട്ടൽ തത്വം വ്യത്യസ്തമായിരിക്കും, അതിനാൽ ചിലപ്പോൾ കണക്കാക്കിയ മൂല്യത്തിന് ചെറിയ വിടവ് ഉണ്ടാകാം.PCR പ്രതികരണങ്ങൾ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുന്നതിന്, 54℃-ൽ കുറയാത്ത അനീലിംഗ് താപനില ഉറപ്പാക്കുന്ന ഏറ്റവും ചെറിയ പ്രൈമറുകൾ മികച്ച കാര്യക്ഷമതയ്ക്കും പ്രത്യേകതയ്ക്കും ഉപയോഗിക്കുന്നു.

മൊത്തത്തിൽ, ഓരോ അധിക ന്യൂക്ലിയോടൈഡിനും പ്രൈമർ പ്രത്യേകത നാല് മടങ്ങ് വർദ്ധിക്കുന്നു, അതിനാൽ മിക്ക ആപ്ലിക്കേഷനുകളുടെയും ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ പ്രൈമർ ദൈർഘ്യം 18 ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളാണ്.പ്രൈമർ ദൈർഘ്യത്തിന്റെ ഉയർന്ന പരിധി വളരെ പ്രധാനമല്ല, പ്രധാനമായും പ്രതികരണ കാര്യക്ഷമതയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.എൻട്രോപ്പി കാരണം, ദൈർഘ്യമേറിയ പ്രൈമർ, ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് ബൈൻഡ് ചെയ്യുന്നതിനായി സ്ഥിരതയുള്ള ഡബിൾ സ്‌ട്രാൻഡഡ് ടെംപ്ലേറ്റ് രൂപീകരിക്കുന്നതിന് ടാർഗെറ്റ് ഡിഎൻഎയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള നിരക്ക് കുറയുന്നു.

പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യാൻ സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, പ്രൈമറുകളുടെ ദൈർഘ്യം TM മൂല്യം അനുസരിച്ച് നിർണ്ണയിക്കാനാകും, പ്രത്യേകിച്ച് ഫ്ലൂറസെൻസ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR-ന്റെ പ്രൈമറുകൾക്ക്, TM=60℃ അല്ലെങ്കിൽ നിയന്ത്രിക്കണം.

2.ജിസി ഉള്ളടക്കം

സാധാരണയായി, പ്രൈമർ സീക്വൻസുകളിലെ G+C യുടെ ഉള്ളടക്കം 40%~60% ആണ്, കൂടാതെ ഒരു ജോടി പ്രൈമറുകളുടെ GC ഉള്ളടക്കവും Tm മൂല്യവും ഏകോപിപ്പിക്കണം.പ്രൈമറിന് ഗുരുതരമായ GC അല്ലെങ്കിൽ AT പ്രവണതയുണ്ടെങ്കിൽ, പ്രൈമറിന്റെ 5' അറ്റത്ത് ഉചിതമായ അളവിൽ A, T അല്ലെങ്കിൽ G, C എന്നിവ ചേർക്കാവുന്നതാണ്.

3. അനീലിംഗ് താപനില

അനീലിംഗ് താപനില അൺചെയിൻ താപനിലയേക്കാൾ 5℃ കുറവായിരിക്കണം.പ്രൈമർ ബേസുകളുടെ എണ്ണം ചെറുതാണെങ്കിൽ, അനീലിംഗ് താപനില ഉചിതമായി വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും, ഇത് പിസിആറിന്റെ പ്രത്യേകത വർദ്ധിപ്പിക്കും.അടിത്തറകളുടെ എണ്ണം വലുതാണെങ്കിൽ, അനീലിംഗ് താപനില ഉചിതമായി കുറയ്ക്കാൻ കഴിയും.4℃ ~ 6℃ പ്രൈമറുകൾ തമ്മിലുള്ള അനീലിംഗ് താപനില വ്യത്യാസം PCR വിളവിനെ ബാധിക്കില്ല, എന്നാൽ ഒരു ജോടി പ്രൈമറുകളുടെ അനീലിംഗ് താപനില ഒന്നുതന്നെയാണ്, ഇത് 55℃ ~ 75℃ വരെ വ്യത്യാസപ്പെടാം.

4. ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ ദ്വിതീയ ഘടന ഏരിയ ഒഴിവാക്കുക

ആംപ്ലിഫൈഡ് ശകലം തിരഞ്ഞെടുക്കുമ്പോൾ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ ദ്വിതീയ ഘടന പ്രദേശം ഒഴിവാക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.ടാർഗെറ്റ് ശകലത്തിന്റെ സ്ഥിരതയുള്ള ദ്വിതീയ ഘടന പ്രസക്തമായ കമ്പ്യൂട്ടർ സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് പ്രവചിക്കാനും കണക്കാക്കാനും കഴിയും, ഇത് ടെംപ്ലേറ്റ് തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന് സഹായകമാണ്.വിപുലീകരിക്കേണ്ട പ്രദേശത്തിന്റെ സ്വതന്ത്ര ഊർജ്ജം (△G) 58.6lkJ/mol-ൽ കുറവായിരിക്കുമ്പോൾ വിപുലീകരണം പലപ്പോഴും പരാജയപ്പെടുമെന്ന് പരീക്ഷണ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.

5. ലക്ഷ്യ ഡിഎൻഎയുമായി പൊരുത്തക്കേട്

ആംപ്ലിഫൈഡ് ടാർഗെറ്റ് ഡിഎൻഎ സീക്വൻസ് വലുതായിരിക്കുമ്പോൾ, ഒരു പ്രൈമർ ടാർഗെറ്റ് ഡിഎൻഎയുടെ ഒന്നിലധികം ഭാഗങ്ങളുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചേക്കാം, അതിന്റെ ഫലമായി ഒന്നിലധികം ബാൻഡുകൾ ഫലത്തിൽ ദൃശ്യമാകും.ഈ സമയം BLAST സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ടെസ്റ്റിംഗ്, വെബ്‌സൈറ്റ് ഉപയോഗിക്കേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.അലൈൻ രണ്ട് സീക്വൻസുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുക (bl2seq).

സോൺ 1-ലേക്ക് പ്രൈമർ സീക്വൻസുകളും സോൺ 2-ലേക്ക് ടാർഗെറ്റ് ഡിഎൻഎ സീക്വൻസുകളും ഒട്ടിക്കുന്നത് പരസ്പരം മാറ്റാവുന്നതാണ്, കൂടാതെ BLAST പൂരകവും ആന്റിസെൻസും മറ്റ് സാധ്യതകളും കണക്കാക്കുന്നു, അതിനാൽ രണ്ട് ശൃംഖലകളും സെൻസ് ചെയിനുകളാണോ എന്ന് ഉപയോക്താക്കൾ ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതില്ല.ഡാറ്റാബേസിലെ സീക്വൻസിന്റെ ജിഐ നമ്പർ നിങ്ങൾക്ക് അറിയാമെങ്കിൽ നിങ്ങൾക്ക് ജിഐ നമ്പർ നൽകാനും കഴിയും, അതിനാൽ നിങ്ങൾ സീക്വൻസിന്റെ വലിയൊരു ഭാഗം പേസ്റ്റ് ചെയ്യേണ്ടതില്ല.അവസാനമായി, ടാർഗെറ്റ് ഡിഎൻഎയിൽ പ്രൈമറിന് ഒന്നിലധികം ഹോമോലോഗസ് സൈറ്റുകൾ ഉണ്ടോ എന്ന് കാണാൻ 3-ൽ അലൈൻ ചെയ്യുക.

6. പ്രൈമർ ടെർമിനൽ

പ്രൈമറിന്റെ 3 അവസാനമാണ് വിപുലീകരണം ആരംഭിക്കുന്നത്, അതിനാൽ പൊരുത്തക്കേടുകൾ അവിടെ ആരംഭിക്കുന്നത് തടയേണ്ടത് പ്രധാനമാണ്.3 'എൻഡ് തുടർച്ചയായി 3 G അല്ലെങ്കിൽ C-യിൽ കൂടുതലാകരുത്, കാരണം ഇത് G+C സമ്പുഷ്ടീകരണ സീക്വൻസ് മേഖലയിൽ പ്രൈമർ തെറ്റായി പ്രവർത്തനക്ഷമമാക്കാൻ ഇടയാക്കും.പ്രത്യേക PCR (AS-PCR) പ്രതികരണങ്ങൾ ഒഴികെ, 3 'എൻഡിന് ഒരു ദ്വിതീയ ഘടനയും ഉണ്ടാക്കാൻ കഴിയില്ല, പ്രൈമറിന്റെ 3' അറ്റം പൊരുത്തപ്പെടുന്നില്ല.ഉദാഹരണത്തിന്, എൻകോഡിംഗ് റീജിയൻ ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്താൽ, കോഡോണിന്റെ മൂന്നാം സ്ഥാനത്ത് പ്രൈമറിന്റെ 3 'എൻഡ് അവസാനിപ്പിക്കരുത്, കാരണം കോഡോണിന്റെ മൂന്നാം സ്ഥാനം ഡീജനറേറ്റ് ചെയ്യാൻ സാധ്യതയുണ്ട്, ഇത് ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ പ്രത്യേകതയെയും കാര്യക്ഷമതയെയും ബാധിക്കും.അനെക്സേഷൻ പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, കോഡൺ ഉപയോഗ പട്ടിക പരിശോധിക്കുക, ബയോളജിക്കൽ മുൻഗണനകൾ ശ്രദ്ധിക്കുക, 3′ അറ്റത്ത് അനെക്സേഷൻ പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കരുത്, പ്രൈമറുകളുടെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത (1uM-3uM) ഉപയോഗിക്കുക.

7. പ്രൈമറുകളുടെ ദ്വിതീയ ഘടന

പ്രൈമറുകൾക്ക് തന്നെ കോംപ്ലിമെന്ററി സീക്വൻസുകൾ ഉണ്ടാകരുത്, അല്ലാത്തപക്ഷം പ്രൈമറുകൾ തന്നെ ഹെയർപിൻ ഘടനകളായി ചുരുട്ടും, കൂടാതെ ഈ ദ്വിതീയ ഘടന സ്റ്റെറിക് തടസ്സം കാരണം പ്രൈമറുകളുടെയും ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെയും ബൈൻഡിംഗിനെ ബാധിക്കും.കൃത്രിമ വിധി ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ, പ്രൈമറുകളുടെ തുടർച്ചയായ അനുബന്ധ അടിത്തറകൾ 3 ബിപിയിൽ കൂടുതലാകരുത്.രണ്ട് പ്രൈമറുകൾക്കിടയിൽ പരസ്പര പൂരകങ്ങൾ ഉണ്ടാകരുത്, പ്രത്യേകിച്ച് പ്രൈമർ ഡൈമറുകളുടെ രൂപീകരണം തടയാൻ 3 'എൻഡിന്റെ കോംപ്ലിമെന്ററി ഓവർലാപ്പ് ഒഴിവാക്കണം.പൊതുവേ, ഒരു ജോടി പ്രൈമറുകൾക്കിടയിൽ തുടർച്ചയായി 4-ൽ കൂടുതൽ ബേസ് ഹോമോളജി അല്ലെങ്കിൽ കോംപ്ലിമെന്ററിറ്റി ഉണ്ടാകരുത്.

8. മാർക്കറുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ലോക്കി ചേർക്കുക

5 'എൻഡ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സ്പെസിഫിക്കറ്റിയിൽ കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നില്ല, അതിനാൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സവിശേഷതയെ ബാധിക്കാതെ തന്നെ പരിഷ്കരിക്കാനാകും.പ്രൈമർ 5'ന്റെ പരിഷ്ക്കരണത്തിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്: എൻസൈം നിയന്ത്രണ സൈറ്റ് ചേർക്കുന്നു;ലേബൽ ചെയ്ത ബയോട്ടിൻ, ഫ്ലൂറസെൻസ്, ഡിഗോക്സിൻ, Eu3+ മുതലായവ. പ്രോട്ടീൻ ബൈൻഡിംഗ് ഡിഎൻഎ സീക്വൻസുകൾ അവതരിപ്പിക്കുക;മ്യൂട്ടേഷൻ സൈറ്റുകൾ അവതരിപ്പിക്കുക, മ്യൂട്ടേഷൻ സീക്വൻസുകൾ ചേർക്കുകയും നഷ്‌ടപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുക, പ്രൊമോട്ടർ സീക്വൻസുകൾ അവതരിപ്പിക്കുക തുടങ്ങിയവ. അധിക ബേസുകൾ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ കാര്യക്ഷമതയെ കൂടുതലോ കുറവോ ബാധിക്കുകയും പ്രൈമർ ഡൈമർ രൂപീകരണത്തിനുള്ള സാധ്യത വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യും, എന്നാൽ അടുത്ത ഘട്ടത്തിനായി ചില ഇളവുകൾ നൽകേണ്ടതുണ്ട്.നിയന്ത്രണ സൈറ്റുകളും പ്രൊമോട്ടർ സീക്വൻസുകളും പോലുള്ള ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസുകളിൽ നിലവിലില്ലാത്ത അധിക സീക്വൻസുകൾ, പ്രത്യേകതയെ ബാധിക്കാതെ പ്രൈമറിന്റെ 5′ അറ്റത്ത് ചേർക്കാവുന്നതാണ്.പ്രൈമർ Tm മൂല്യങ്ങളുടെ കണക്കുകൂട്ടലിൽ ഈ സീക്വൻസുകൾ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടില്ല, എന്നാൽ പരസ്പര പൂരകതയ്ക്കും ആന്തരിക ദ്വിതീയ ഘടനയ്ക്കും വേണ്ടി പരിശോധിക്കേണ്ടതാണ്.

9. ഉപക്ലോണുകൾ

മിക്കപ്പോഴും, പി‌സി‌ആർ പ്രാഥമിക ക്ലോണിംഗ് മാത്രമാണ്, തുടർന്ന് ഞങ്ങൾ ടാർഗെറ്റ് ശകലത്തെ വിവിധ വെക്‌റ്ററുകളിലേക്ക് സബ്‌ക്ലോൺ ചെയ്യേണ്ടതുണ്ട്, അതിനാൽ പിസിആർ ഘട്ടത്തിൽ അടുത്ത പ്രവർത്തനത്തിനായി ഞങ്ങൾ അധിക അടിത്തറകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യേണ്ടതുണ്ട്.

സബ്ക്ലോണിംഗിനായി രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത ചില സീക്വൻസുകൾ ചുവടെ സംഗ്രഹിച്ചിരിക്കുന്നു.
നിയന്ത്രണ എൻഡോന്യൂക്ലീസ് നിയന്ത്രണ സൈറ്റ് ചേർത്തു

എൻസൈം നിയന്ത്രണ സൈറ്റുകൾ ചേർക്കുന്നത് പിസിആർ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ സബ്ക്ലോണിംഗിനായി ഏറ്റവും സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന രീതിയാണ്.സാധാരണയായി, പിളർപ്പ് സൈറ്റിന്റെ 5 'അറ്റം കൂടാതെ, 2 ~ 3 സംരക്ഷിത അടിത്തറകൾ ചേർക്കേണ്ടതുണ്ട്.എന്നിരുന്നാലും, വ്യത്യസ്ത എൻസൈമുകൾക്ക് ആവശ്യമായ സംരക്ഷണ അടിത്തറകളുടെ എണ്ണം വ്യത്യസ്തമാണ്.ഉദാഹരണത്തിന്, SalⅠ ന് സംരക്ഷണ അടിത്തറ ആവശ്യമില്ല, EcoRⅤ ന് 1 സംരക്ഷണ അടിത്തറ ആവശ്യമാണ്, NotⅠ ന് 2 സംരക്ഷിത അടിത്തറകൾ ആവശ്യമാണ്, കൂടാതെ Hind Ⅲ ന് 3 സംരക്ഷണ അടിത്തറകൾ ആവശ്യമാണ്.

എൽഐസി വാൽ ചേർക്കുന്നു

എൽഐസിയുടെ മുഴുവൻ പേര് ലിഗേഷൻ-ഇൻഡിപെൻഡന്റ് ക്ലോണിംഗ് എന്നാണ്, ഇത് pET വെക്റ്ററിന്റെ ഭാഗത്തിനായി പ്രത്യേകമായി നവോജൻ കണ്ടുപിടിച്ച ഒരു ക്ലോണിംഗ് രീതിയാണ്.എൽഐസി രീതി തയ്യാറാക്കിയ പിഇടി കാരിയറിന് പൂരകമല്ലാത്ത 12-15 ബേസ് സിംഗിൾ സ്‌ട്രാൻഡ് സ്റ്റിക്കി അറ്റങ്ങൾ ഉണ്ട്, ഇത് ടാർഗെറ്റ് ഇൻസേർട്ട് ഫ്രാഗ്‌മെന്റിലെ അനുബന്ധ സ്റ്റിക്കി അറ്റങ്ങളെ പൂർത്തീകരിക്കുന്നു.ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ആവശ്യങ്ങൾക്കായി, തിരുകിയ ശകലത്തിന്റെ പ്രൈമർ 5′ സീക്വൻസ് എൽഐസി വെക്‌ടറിനെ പൂരകമാക്കണം.T4 ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെ 3′→5′ എക്സ്ട്രാനെക്റ്റ് ആക്റ്റിവിറ്റി, കുറച്ച് സമയത്തിന് ശേഷം തിരുകിയ ശകലത്തിൽ ഒരൊറ്റ സ്ട്രാൻഡ് സ്റ്റിക്കി അറ്റം ഉണ്ടാക്കും.തയ്യാറാക്കിയ ഇൻസേർട്ട് ഫ്രാഗ്മെന്റിന്റെയും വെക്റ്ററിന്റെയും പരസ്പര അനീലിംഗിൽ നിന്ന് മാത്രമേ ഉൽപ്പന്നം രൂപപ്പെടുത്താൻ കഴിയൂ എന്നതിനാൽ, ഈ രീതി വളരെ വേഗമേറിയതും കാര്യക്ഷമവുമാണ്, മാത്രമല്ല ഇത് ക്ലോണിംഗ് നടത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.
ഡയറക്‌റ്റ് ചെയ്‌ത TA ക്ലോൺ ആഡ് ടെയിൽ
ടിഎ ക്ലോണിങ്ങിന് ശകലത്തെ ഒരു വെക്‌ടറിലേക്ക് ടാർഗെറ്റുചെയ്യാൻ കഴിഞ്ഞില്ല, അതിനാൽ പിന്നീട് ഇൻവിട്രോജൻ ഒരു വെക്‌ടർ അവതരിപ്പിച്ചു, അത് ക്ലോണിംഗിനെ ലക്ഷ്യമിടുന്നു, അതിൽ ഒരു അറ്റത്ത് നാല് പ്രമുഖ ബേസ് ജിടിജിജിഎസ് അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.അതിനാൽ, പിസിആർ പ്രൈമറുകളുടെ രൂപകൽപ്പനയിൽ, അനുബന്ധ ശ്രേണികൾ അതിനനുസരിച്ച് ചേർക്കണം, അങ്ങനെ ശകലങ്ങൾ "ഓറിയന്റഡ്" ആകാൻ കഴിയും.

നിങ്ങൾക്ക് സമയക്കുറവുണ്ടെങ്കിൽ, ജീനിനെ വെക്‌ടറുമായി സംയോജിപ്പിച്ച് നിങ്ങൾക്ക് നേരിട്ടുള്ള സംശ്ലേഷണം പരീക്ഷിക്കാം, ഇതിനെയാണ് ഞങ്ങൾ മ്യൂസിക്യുലറിസ്റ്റുകളിൽ ET ജീൻ സിന്തസിസ് എന്ന് വിളിക്കുന്നത്.

D. ഇൻ-ഫ്യൂഷൻ ക്ലോണിംഗ് രീതി

ലിഗേസ് ആവശ്യമില്ല, നീണ്ട പ്രതികരണം ആവശ്യമില്ല.പ്രൈമറുകളുടെ രൂപകൽപ്പനയിൽ ലീനിയറൈസ്ഡ് വെക്‌ടറിന്റെ രണ്ടറ്റത്തും ഒരു സീക്വൻസ് അവതരിപ്പിക്കുന്നിടത്തോളം, പിസിആർ ഉൽപ്പന്നവും ലീനിയറൈസ്ഡ് വെക്‌ടറും ബിഎസ്‌എ അടങ്ങിയ ഇൻ-ഫ്യൂഷൻ എൻസൈം ലായനിയിൽ ചേർത്ത് അരമണിക്കൂറോളം റൂം ടെമ്പറേച്ചറിൽ വയ്ക്കുന്നിടത്തോളം, പരിവർത്തനം നടത്താൻ കഴിയും.വലിയ വോളിയം പരിവർത്തനത്തിന് ഈ രീതി പ്രത്യേകിച്ചും അനുയോജ്യമാണ്.

10. പ്രൈമർ ലയിപ്പിക്കുക

ചിലപ്പോൾ, പ്രൈമർ ഡിസൈനിനെക്കുറിച്ച് പരിമിതമായ ശ്രേണി വിവരങ്ങൾ മാത്രമേ അറിയൂ.ഉദാഹരണത്തിന്, അമിനോ ആസിഡ് സീക്വൻസ് മാത്രം അറിയാമെങ്കിൽ, മെർജിംഗ് പ്രൈമർ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യാൻ കഴിയും.ഒരൊറ്റ അമിനോ ആസിഡിനെ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന എല്ലാ വ്യത്യസ്ത അടിസ്ഥാന സാധ്യതകളെയും പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന വ്യത്യസ്ത ശ്രേണികളുടെ മിശ്രിതമാണ് ലയന പ്രൈമർ.പ്രത്യേകത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന്, വ്യത്യസ്ത ജീവികളുടെ അടിസ്ഥാന ഉപയോഗ മുൻഗണനകൾ അനുസരിച്ച് കൂട്ടിച്ചേർക്കൽ കുറയ്ക്കുന്നതിന് നിങ്ങൾക്ക് കോഡൺ ഉപയോഗ പട്ടിക നോക്കാവുന്നതാണ്.പ്രൈമറിന്റെ അനീലിംഗ് താപനില കുറയ്ക്കുന്നതിന് ഹൈപ്പോക്സാന്റൈൻ എല്ലാ ബേസുകളുമായും ജോടിയാക്കാം.പ്രൈമറിന്റെ 3′ അറ്റത്ത് അനെക്‌സ് ചെയ്‌ത ബേസുകൾ ഉപയോഗിക്കരുത്, കാരണം തെറ്റായ സൈറ്റിൽ PCR ആരംഭിക്കാൻ 3′ അറ്റത്തുള്ള അവസാന 3 ബേസുകളുടെ അനീലിംഗ് മതിയാകും.ഉയർന്ന പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷനുകൾ (1μM മുതൽ 3μM വരെ) ഉപയോഗിക്കുന്നു, കാരണം പല അനെക്സേഷൻ മിശ്രിതങ്ങളിലുമുള്ള പ്രൈമറുകൾ ടാർഗെറ്റ് ടെംപ്ലേറ്റിന് പ്രത്യേകമല്ല.

പിസിആർ അസംസ്കൃത വസ്തുക്കൾനിയന്ത്രണം

1. പ്രൈമർ അളവ്

ഓരോ പ്രൈമറിന്റെയും സാന്ദ്രത 0.1 ~ 1umol അല്ലെങ്കിൽ 10 ~ 100pmol ആണ്.പ്രൈമറിന്റെ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ തുക ഉപയോഗിച്ച് ആവശ്യമായ ഫലം ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.പ്രൈമറിന്റെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത പൊരുത്തക്കേടും നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും കാരണമാകും, കൂടാതെ പ്രൈമറുകൾക്കിടയിൽ ഡൈമറുകൾ രൂപപ്പെടാനുള്ള സാധ്യത വർദ്ധിപ്പിക്കും.

2. പ്രൈമർ ഏകാഗ്രത

പ്രൈമറുകളുടെ ഏകാഗ്രത പ്രത്യേകതയെ ബാധിക്കുന്നു.ഒപ്റ്റിമൽ പ്രൈമർ കോൺസൺട്രേഷൻ സാധാരണയായി 0.1 മുതൽ 0.5μM വരെയാണ്.ഉയർന്ന പ്രൈമർ സാന്ദ്രത, നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ വർദ്ധനവിന് കാരണമാകുന്നു.

3. പ്രൈമറിന്റെ അനീലിംഗ് താപനില

പ്രൈമറുകൾക്കുള്ള മറ്റൊരു പ്രധാന പാരാമീറ്റർ ഉരുകൽ താപനിലയാണ് (Tm).50% പ്രൈമറുകളും കോംപ്ലിമെന്ററി സീക്വൻസുകളും ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ തന്മാത്രകളായി പ്രതിനിധീകരിക്കുമ്പോൾ ഇത് താപനിലയാണ്.PCR അനീലിംഗ് താപനില സജ്ജീകരിക്കാൻ Tm ആവശ്യമാണ്.ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസിനൊപ്പം പ്രൈമറുകളുടെ ഫലപ്രദമായ അനീലിംഗ് ഉറപ്പാക്കാൻ അനീലിംഗ് താപനില പര്യാപ്തമാണ്, പക്ഷേ നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ബൈൻഡിംഗ് കുറയ്ക്കാൻ പര്യാപ്തമാണ്.55℃ മുതൽ 70℃ വരെ ന്യായമായ അനീലിംഗ് താപനില.അനീലിംഗ് താപനില സാധാരണയായി പ്രൈമറിനേക്കാൾ 5℃ കുറവാണ് സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നത്.

Tm സജ്ജീകരിക്കുന്നതിന് നിരവധി സൂത്രവാക്യങ്ങളുണ്ട്, അവ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഫോർമുലയെയും പ്രൈമറുകളുടെ ക്രമത്തെയും ആശ്രയിച്ച് വളരെ വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.മിക്ക സൂത്രവാക്യങ്ങളും കണക്കാക്കിയ Tm മൂല്യം നൽകുന്നതിനാൽ, എല്ലാ അനീലിംഗ് താപനിലകളും ഒരു ആരംഭ പോയിന്റ് മാത്രമാണ്.അനീലിംഗ് താപനില ക്രമാനുഗതമായി ഉയർത്തുന്ന നിരവധി പ്രതികരണങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിലൂടെ പ്രത്യേകത മെച്ചപ്പെടുത്താൻ കഴിയും.കണക്കാക്കിയ Tm-5℃-ന് താഴെ ആരംഭിക്കുക, 2℃ വർദ്ധനവിൽ അനിയലിംഗ് താപനില ക്രമേണ വർദ്ധിപ്പിക്കുക.ഉയർന്ന അനീലിംഗ് താപനില പ്രൈമർ ഡൈമറുകളുടെയും നോൺ-സ്പെസിഫിക് ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെയും രൂപീകരണം കുറയ്ക്കും.മികച്ച ഫലങ്ങൾക്കായി, രണ്ട് പ്രൈമറുകൾക്ക് ഏകദേശ Tm മൂല്യങ്ങൾ ഉണ്ടായിരിക്കണം.പ്രൈമർ ജോഡികളുടെ Tm വ്യത്യാസം 5℃-ൽ കൂടുതലാണെങ്കിൽ, സൈക്കിളിൽ കുറഞ്ഞ അനീലിംഗ് താപനില ഉപയോഗിച്ച് പ്രൈമറുകൾ കാര്യമായ തെറ്റായ തുടക്കം കാണിക്കും.രണ്ട് പ്രൈമറുകൾ Tm വ്യത്യസ്‌തമാണെങ്കിൽ, അനീലിംഗ് താപനില ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ Tm-നേക്കാൾ 5℃ ആയി സജ്ജീകരിക്കുക.മറ്റൊരു തരത്തിൽ, പ്രത്യേകത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന്, ഉയർന്ന Tm ന് വേണ്ടി രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത അനീലിംഗ് താപനിലയിൽ അഞ്ച് സൈക്കിളുകൾ ആദ്യം നടത്താം, തുടർന്ന് കുറഞ്ഞ Tm ന് വേണ്ടി രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത അനീലിംഗ് താപനിലയിൽ ശേഷിക്കുന്ന സൈക്കിളുകൾ നടത്താം.ഇറുകിയ സാഹചര്യങ്ങളിൽ ലക്ഷ്യസ്ഥാന ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ ഭാഗിക പകർപ്പ് ലഭിക്കാൻ ഇത് അനുവദിക്കുന്നു.

4. പ്രൈമർ പരിശുദ്ധിയും സ്ഥിരതയും

മിക്ക PCR ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്കും ഇഷ്‌ടാനുസൃത പ്രൈമറുകളുടെ സ്റ്റാൻഡേർഡ് പ്യൂരിറ്റി മതിയാകും.desalting വഴി benzoyl, isobutylyl ഗ്രൂപ്പുകൾ നീക്കം ചെയ്യുന്നത് വളരെ കുറവാണ്, അതിനാൽ PCR-ൽ ഇടപെടുന്നില്ല.സിന്തസിസ് പ്രക്രിയയിൽ മുഴുനീളമല്ലാത്ത സീക്വൻസുകൾ നീക്കം ചെയ്യാൻ ചില ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്ക് ശുദ്ധീകരണം ആവശ്യമാണ്.ഡിഎൻഎ സിന്തസിസ് കെമിസ്ട്രിയുടെ കാര്യക്ഷമത 100% അല്ലാത്തതിനാലാണ് ഈ വെട്ടിച്ചുരുക്കിയ സീക്വൻസുകൾ ഉണ്ടാകുന്നത്.3′ മുതൽ 5′ വരെ ഡിഎൻഎ ഉണ്ടാക്കാൻ ഓരോ അടിത്തറയും ചേർക്കുമ്പോൾ ആവർത്തിച്ചുള്ള രാസപ്രവർത്തനങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു വൃത്താകൃതിയിലുള്ള പ്രക്രിയയാണിത്.ഏത് സൈക്കിളിലും നിങ്ങൾക്ക് പരാജയപ്പെടാം.ദൈർഘ്യമേറിയ പ്രൈമറുകൾ, പ്രത്യേകിച്ച് 50 ബേസുകളിൽ കൂടുതലുള്ളവ, വെട്ടിച്ചുരുക്കിയ സീക്വൻസുകളുടെ വലിയൊരു അനുപാതം ഉള്ളതിനാൽ ശുദ്ധീകരണം ആവശ്യമായി വന്നേക്കാം.

പ്രൈമറുകളുടെ വിളവ് സിന്തറ്റിക് കെമിസ്ട്രിയുടെയും ശുദ്ധീകരണ രീതിയുടെയും കാര്യക്ഷമതയെ ബാധിക്കുന്നു.ബയോഫാർമസ്യൂട്ടിക്കൽ കമ്പനികളായ സൈറ്റോളജി, ഷെൻഗോംഗ് എന്നിവയെല്ലാം ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോസൈഡിന്റെ മൊത്തം ഉൽപ്പാദനം ഉറപ്പാക്കാൻ മിനിമം OD യൂണിറ്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഇഷ്‌ടാനുസൃത പ്രൈമറുകൾ ഉണങ്ങിയ പൊടി രൂപത്തിലാണ് അയയ്‌ക്കുന്നത്.TE-യിലെ പ്രൈമറുകൾ വീണ്ടും പിരിച്ചുവിടുന്നതാണ് നല്ലത്, അങ്ങനെ അന്തിമ സാന്ദ്രത 100μM ആണ്.ഡീയോണൈസ്ഡ് വെള്ളത്തേക്കാൾ മികച്ചതാണ് ടിഇ, കാരണം വെള്ളത്തിന്റെ പിഎച്ച് പലപ്പോഴും അസിഡിറ്റി ഉള്ളതിനാൽ ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോസൈഡുകളുടെ ജലവിശ്ലേഷണത്തിന് കാരണമാകും.

പ്രൈമറുകളുടെ സ്ഥിരത സ്റ്റോറേജ് അവസ്ഥയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.ഉണങ്ങിയ പൊടിയും അലിയിച്ച പ്രൈമറുകളും -20 ഡിഗ്രിയിൽ സൂക്ഷിക്കണം.10μM-ൽ കൂടുതൽ സാന്ദ്രതയിൽ TE-യിൽ ലയിപ്പിച്ച പ്രൈമറുകൾ -20℃-ൽ 6 മാസത്തേക്ക് സ്ഥിരമായി സൂക്ഷിക്കാം, എന്നാൽ ഊഷ്മാവിൽ (15℃ മുതൽ 30℃ വരെ) 1 ആഴ്ചയിൽ താഴെ മാത്രമേ സൂക്ഷിക്കാൻ കഴിയൂ.ഡ്രൈ പൗഡർ പ്രൈമറുകൾ -20 C താപനിലയിൽ കുറഞ്ഞത് 1 വർഷവും ഊഷ്മാവിൽ (15 C മുതൽ 30 C വരെ) 2 മാസം വരെ സൂക്ഷിക്കാം.

5. എൻസൈമുകളും അവയുടെ സാന്ദ്രതയും

നിലവിൽ, Taq DNA പോളിമറേസ് ഉപയോഗിക്കുന്നത് അടിസ്ഥാനപരമായി കോളിഫോം ബാക്ടീരിയയാൽ സമന്വയിപ്പിച്ച ജീൻ എഞ്ചിനീയറിംഗ് എൻസൈമാണ്.ഒരു സാധാരണ PCR പ്രതികരണത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കാൻ ആവശ്യമായ എൻസൈമിന്റെ അളവ് ഏകദേശം 2.5U ആണ് (100ul ന്റെ മൊത്തം പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന്റെ അളവ് സൂചിപ്പിക്കുന്നു).സാന്ദ്രത വളരെ ഉയർന്നതാണെങ്കിൽ, അത് നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷനിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം;സാന്ദ്രത വളരെ കുറവാണെങ്കിൽ, സിന്തറ്റിക് ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ അളവ് കുറയും.

6. dNTP യുടെ ഗുണനിലവാരവും സാന്ദ്രതയും

ഡിഎൻടിപിയുടെ ഗുണനിലവാരം പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ സാന്ദ്രതയുമായും കാര്യക്ഷമതയുമായും അടുത്ത ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.dNTP പൗഡർ ഗ്രാനുലാർ ആണ്, അത് അനുചിതമായി സംഭരിച്ചാൽ അതിന്റെ വ്യതിയാനത്തിന് അതിന്റെ ജൈവിക പ്രവർത്തനം നഷ്ടപ്പെടും.dNTP ലായനി അസിഡിറ്റി ഉള്ളതാണ്, 1M NaOH അല്ലെങ്കിൽ 1M Tris.HCL ബഫർ ലായനി ഉപയോഗിച്ച് ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിൽ ഉപയോഗിക്കണം, അതിന്റെ PH 7.0 ~ 7.5 ആയി ക്രമീകരിക്കാൻ, ചെറിയ അളവിലുള്ള സബ്-പാക്കേജിംഗ്, ഫ്രോസൻ സ്റ്റോറേജ് -20℃.ഒന്നിലധികം ഫ്രീസ്-ഥവിംഗ് ഡിഎൻടിപിയെ തരംതാഴ്ത്തും.PCR പ്രതികരണത്തിൽ, dNTP 50 ~ 200umol/L ആയിരിക്കണം.പ്രത്യേകിച്ചും, നാല് ഡിഎൻ‌ടി‌പി‌എസിന്റെ ഏകാഗ്രത തുല്യമായിരിക്കണം (തുല്യ മോൾ തയ്യാറാക്കൽ) ശ്രദ്ധിക്കണം.അവയിലേതെങ്കിലും ഒന്നിന്റെ ഏകാഗ്രത മറ്റുള്ളവയിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണെങ്കിൽ (കൂടുതലോ താഴ്ന്നതോ), പൊരുത്തക്കേട് സംഭവിക്കും.വളരെ കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രത PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ വിളവ് കുറയ്ക്കും.dNTP ന് Mg2+ മായി സംയോജിപ്പിക്കാനും സ്വതന്ത്ര Mg2+ ന്റെ സാന്ദ്രത കുറയ്ക്കാനും കഴിയും.

7. ടെംപ്ലേറ്റ് (ടാർഗെറ്റ് ജീൻ) ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ്

ടെംപ്ലേറ്റ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡിന്റെ അളവും ശുദ്ധീകരണ ബിരുദവും PCR-ന്റെ വിജയത്തിനും പരാജയത്തിനുമുള്ള പ്രധാന കണ്ണികളിൽ ഒന്നാണ്.പരമ്പരാഗത ഡിഎൻഎ ശുദ്ധീകരണ രീതികൾ സാധാരണയായി എസ്ഡിഎസും പ്രോട്ടീസ് കെയും ഉപയോഗിക്കുന്നു.SDS ന്റെ പ്രധാന പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഇവയാണ്: കോശ സ്തരത്തിലെ ലിപിഡുകളും പ്രോട്ടീനുകളും ലയിപ്പിക്കുക, അങ്ങനെ മെംബ്രൻ പ്രോട്ടീനുകളെ ലയിപ്പിച്ച് കോശ സ്തരത്തെ നശിപ്പിക്കുകയും സെല്ലിലെ ന്യൂക്ലിയർ പ്രോട്ടീനുകളെ വേർപെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു, SDS ന് പ്രോട്ടീനുകളുമായി സംയോജിപ്പിച്ച് അവശിഷ്ടമാക്കാനും കഴിയും;പ്രോട്ടീസ് കെയ്ക്ക് പ്രോട്ടീനുകളെ ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യാനും ദഹിപ്പിക്കാനും കഴിയും, പ്രത്യേകിച്ച് ഡിഎൻഎയുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ഹിസ്റ്റോണുകൾ, തുടർന്ന് പ്രോട്ടീനുകളും മറ്റ് കോശ ഘടകങ്ങളും വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ ഓർഗാനിക് സോൾവെന്റ് ഫിനോൾ, ക്ലോറോഫോം എന്നിവ ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡിനെ പ്രേരിപ്പിക്കാൻ എത്തനോൾ അല്ലെങ്കിൽ ഐസോപ്രോപൈൽ ആൽക്കഹോൾ ഉപയോഗിക്കുക.വേർതിരിച്ചെടുത്ത ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് പിസിആർ പ്രതികരണങ്ങൾക്കുള്ള ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കാം.പൊതുവായ ക്ലിനിക്കൽ ഡിറ്റക്ഷൻ മാതൃകകൾക്കായി, കോശങ്ങളെ അലിയിക്കാനും, രോഗകാരികളെ ലൈസേറ്റ് ചെയ്യാനും, ക്രോമസോമുകളിൽ നിന്ന് ഫ്രീ ടാർഗെറ്റ് ജീനുകളിലേക്കുള്ള പ്രോട്ടീനുകളെ ദഹിപ്പിക്കാനും നീക്കം ചെയ്യാനും ദ്രുതവും ലളിതവുമായ ഒരു രീതി ഉപയോഗിക്കാം, കൂടാതെ PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി നേരിട്ട് ഉപയോഗിക്കാനും കഴിയും.ആർഎൻഎയെ തരംതാഴ്ത്തുന്നതിൽ നിന്ന് ആർഎൻഎയെ തടയാൻ ആർഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റ് വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ സാധാരണയായി ഗ്വാനിഡിൻ ഐസോത്തിയോസയനേറ്റ് അല്ലെങ്കിൽ പ്രോട്ടീസ് കെ രീതി ഉപയോഗിക്കുന്നു.

8.Mg2+ ഏകാഗ്രത

PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ പ്രത്യേകതയിലും വിളവിലും Mg2+ കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നു.പൊതുവായ PCR പ്രതികരണത്തിൽ, വിവിധ dNTP യുടെ സാന്ദ്രത 200umol/L ആയിരിക്കുമ്പോൾ, Mg2+ ന്റെ ഉചിതമായ സാന്ദ്രത 1.5 ~ 2.0mmol/L ആണ്.Mg2+ കോൺസൺട്രേഷൻ വളരെ കൂടുതലാണ്, പ്രതികരണത്തിന്റെ പ്രത്യേകത കുറയുന്നു, നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സംഭവിക്കുന്നു, വളരെ കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രത ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെ പ്രവർത്തനത്തെ കുറയ്ക്കും, അതിന്റെ ഫലമായി പ്രതികരണ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ കുറയുന്നു.

മഗ്നീഷ്യം അയോണുകൾ പിസിആറിന്റെ വിവിധ വശങ്ങളെ ബാധിക്കുന്നു, ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനം, ഇത് വിളവിനെ ബാധിക്കുന്നു;മറ്റൊരു ഉദാഹരണം പ്രൈമർ അനീലിംഗ് ആണ്, ഇത് പ്രത്യേകതയെ ബാധിക്കുന്നു.ഡിഎൻടിപിയും ടെംപ്ലേറ്റും മഗ്നീഷ്യം അയോണുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു, എൻസൈം പ്രവർത്തനത്തിന് ആവശ്യമായ സ്വതന്ത്ര മഗ്നീഷ്യം അയോണിന്റെ അളവ് കുറയ്ക്കുന്നു.വ്യത്യസ്ത പ്രൈമർ ജോഡികൾക്കും ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്കും ഒപ്റ്റിമൽ മഗ്നീഷ്യം അയോൺ കോൺസൺട്രേഷൻ വ്യത്യാസപ്പെടുന്നു, എന്നാൽ 200μM dNTP ഉള്ള ഒരു സാധാരണ PCR ആരംഭ കോൺസൺട്രേഷൻ 1.5mM ആണ് (ശ്രദ്ധിക്കുക: തത്സമയ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR-ന്, ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബ് ഉപയോഗിച്ച് 3 മുതൽ 5mM വരെ മഗ്നീഷ്യം അയോൺ ലായനി ഉപയോഗിക്കുക).സ്വതന്ത്ര മഗ്നീഷ്യം അയോണുകളുടെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത വിളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു, മാത്രമല്ല നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും വിശ്വാസ്യത കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.ഒപ്റ്റിമൽ കോൺസൺട്രേഷൻ നിർണ്ണയിക്കാൻ, മഗ്നീഷ്യം അയോൺ ടൈറ്ററേഷനുകൾ 1mM മുതൽ 3mM വരെ 0.5mM വർദ്ധനവിൽ നടത്തി.മഗ്നീഷ്യം അയോൺ ഒപ്റ്റിമൈസേഷനെ ആശ്രയിക്കുന്നത് കുറയ്ക്കാൻ, പ്ലാറ്റിനം ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് ഉപയോഗിക്കാം.പ്ലാറ്റിനം ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന് ടാക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിനേക്കാൾ വിശാലമായ മഗ്നീഷ്യം അയോൺ സാന്ദ്രതയിൽ പ്രവർത്തനം നിലനിർത്താൻ കഴിയും, അതിനാൽ കുറഞ്ഞ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ ആവശ്യമാണ്.

9. പിസിആർ-പ്രമോട്ടിംഗ് അഡിറ്റീവുകൾ

അനീലിംഗ് താപനില, പ്രൈമർ ഡിസൈൻ, മഗ്നീഷ്യം അയോൺ കോൺസൺട്രേഷൻ എന്നിവയുടെ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ മിക്ക ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെയും വളരെ നിർദ്ദിഷ്ട ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി മതിയാകും;എന്നിരുന്നാലും, ഉയർന്ന GC ഉള്ളടക്കമുള്ളവ ഉൾപ്പെടെയുള്ള ചില ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്ക് അധിക നടപടികൾ ആവശ്യമാണ്.ഡിഎൻഎയുടെ ഉരുകൽ താപനിലയെ ബാധിക്കുന്ന അഡിറ്റീവുകൾ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ പ്രത്യേകതയും വിളവും മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനുള്ള മറ്റൊരു മാർഗം നൽകുന്നു.മികച്ച ഫലങ്ങൾക്കായി ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ പൂർണ്ണമായ ഡീനാറ്ററേഷൻ ആവശ്യമാണ്.

കൂടാതെ, ദ്വിതീയ ഘടന പ്രൈമർ ബൈൻഡിംഗും എൻസൈം വിപുലീകരണവും തടയുന്നു.

ഫോർമൈഡ്, ഡിഎംഎസ്ഒ, ഗ്ലിസറിൻ, ബീറ്റൈൻ, പിസിആർഎക്സ് എൻഹാൻസർ സൊല്യൂഷൻ എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള പിസിആർ അഡിറ്റീവുകൾ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നു.ഉരുകുന്ന താപനില കുറയ്ക്കുക എന്നതാണ് അവയുടെ സാധ്യമായ സംവിധാനം, അങ്ങനെ പ്രൈമറുകളുടെ അനീലിംഗ് സഹായിക്കുകയും ദ്വിതീയ ഘടന മേഖലയിലൂടെ ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് വിപുലീകരണത്തെ സഹായിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.PCRx സൊല്യൂഷന് മറ്റ് ഗുണങ്ങളുണ്ട്.പ്ലാറ്റിനം ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ്, പ്ലാറ്റിനം പിഎഫ്എക്സ് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് എന്നിവയ്ക്കൊപ്പം ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ കുറഞ്ഞ മഗ്നീഷ്യം അയോൺ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ ആവശ്യമാണ്.അങ്ങനെ, പ്ലാറ്റിനം ടെക്നിക്, മഗ്നീഷ്യം അയോൺ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ എന്ന മൂന്നാമത്തെ സമീപനത്തിന്റെ ആശ്രിതത്വം കുറയ്ക്കുമ്പോൾ, പ്രത്യേകത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള അഡിറ്റീവുമായി സംയോജിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു.മികച്ച ഫലങ്ങൾക്കായി, അഡിറ്റീവുകളുടെ സാന്ദ്രത ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യണം, പ്രത്യേകിച്ച് ടാക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിനെ തടയുന്ന ഡിഎംഎസ്ഒ, ഫോർമൈഡ്, ഗ്ലിസറോൾ.

 ഫോറേസി ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ്

10. ചൂടുള്ള തുടക്കം

നല്ല പ്രൈമർ ഡിസൈൻ കൂടാതെ PCR പ്രത്യേകത മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനുള്ള ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട രീതികളിൽ ഒന്നാണ് ഹോട്ട് സ്റ്റാർട്ട് PCR.ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെ ഒപ്റ്റിമൽ നീളൻ താപനില 72℃ ആണെങ്കിലും, പോളിമറേസ് ഊഷ്മാവിൽ സജീവമായി തുടരുന്നു.അങ്ങനെ, പിസിആർ പ്രതികരണം തയ്യാറാക്കുന്ന സമയത്തും താപ ചക്രത്തിന്റെ തുടക്കത്തിലും ഹോൾഡിംഗ് താപനില അനീലിംഗ് താപനിലയേക്കാൾ കുറവായിരിക്കുമ്പോൾ നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ നിർമ്മിക്കപ്പെടുന്നു.രൂപീകരിച്ചുകഴിഞ്ഞാൽ, ഈ നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ഫലപ്രദമായി വർദ്ധിപ്പിക്കും.പ്രൈമർ ഡിസൈനിനായി ഉപയോഗിക്കുന്ന സൈറ്റുകൾ, സൈറ്റ്-ഡയറക്‌ടഡ് മ്യൂട്ടേഷനുകൾ, എക്‌സ്‌പ്രഷൻ ക്ലോണിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ ഡിഎൻഎ എഞ്ചിനീയറിങ്ങിന് ഉപയോഗിക്കുന്ന ജനിതക മൂലകങ്ങളുടെ നിർമ്മാണവും കൃത്രിമത്വവും പോലുള്ള ജനിതക ഘടകങ്ങളുടെ സ്ഥാനത്താൽ പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുമ്പോൾ ഹോട്ട്-സ്റ്റാർട്ട് പിസിആർ പ്രത്യേകിച്ചും ഫലപ്രദമാണ്.

ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെ പ്രവർത്തനം പരിമിതപ്പെടുത്തുന്നതിനുള്ള ഒരു പൊതു രീതി ഐസിൽ പിസിആർ പ്രതികരണ പരിഹാരം തയ്യാറാക്കി പ്രീഹീറ്റ് ചെയ്ത പിസിആർ ഉപകരണത്തിൽ സ്ഥാപിക്കുക എന്നതാണ്.ഈ രീതി ലളിതവും ചെലവുകുറഞ്ഞതുമാണ്, എന്നാൽ ഇത് എൻസൈമിന്റെ പ്രവർത്തനം പൂർത്തിയാക്കുന്നില്ല, അതിനാൽ നോൺ-സ്പെസിഫിക് ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പൂർണ്ണമായും ഒഴിവാക്കില്ല.

പിസിആർ ഉപകരണം ഡീനാറ്ററേഷൻ താപനിലയിൽ എത്തുന്നതുവരെ ഒരു അവശ്യ ഘടകത്തെ തടഞ്ഞുകൊണ്ട് തെർമൽ പ്രൈമിംഗ് ഡിഎൻഎ സിന്തസിസ് വൈകിപ്പിക്കുന്നു.ടാക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെ കാലതാമസം ഉൾപ്പെടെയുള്ള മിക്ക മാനുവൽ തെർമൽ ഇനീഷ്യേഷൻ രീതികളും ബുദ്ധിമുട്ടാണ്, പ്രത്യേകിച്ച് ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്ക്.മറ്റ് തെർമൽ പ്രൈമിംഗ് രീതികൾ മഗ്നീഷ്യം അയോണുകൾ അല്ലെങ്കിൽ എൻസൈമുകൾ ഉൾപ്പെടെയുള്ള ഒരു അവശ്യ ഘടകത്തെ ഉൾക്കൊള്ളുന്നതിനോ അല്ലെങ്കിൽ ടെംപ്ലേറ്റുകളും ബഫറുകളും പോലുള്ള റിയാക്ടീവ് ഘടകങ്ങളെ ശാരീരികമായി വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിനോ ഒരു മെഴുക് ഷീൽഡ് ഉപയോഗിക്കുന്നു.തെർമൽ സൈക്കിളിൽ, മെഴുക് ഉരുകുമ്പോൾ വിവിധ ഘടകങ്ങൾ പുറത്തുവിടുകയും ഒന്നിച്ച് കലർത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.മാനുവൽ ഹോട്ട് സ്റ്റാർട്ട് രീതി പോലെ, മെഴുക് ഷീൽഡ് രീതി ബുദ്ധിമുട്ടുള്ളതും മലിനീകരണത്തിന് സാധ്യതയുള്ളതും ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്ക് അനുയോജ്യവുമല്ല.

ഓട്ടോമാറ്റിക് ഹോട്ട് സ്റ്റാർട്ട് പിസിആറിന് പ്ലാറ്റിനം ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് സൗകര്യപ്രദവും കാര്യക്ഷമവുമാണ്.പ്ലാറ്റിനം ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിൽ ടാക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിനെതിരെ മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡിയുമായി സംയോജിപ്പിച്ച് റീകോമ്പിനന്റ് ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.ദീർഘനേരം താപനില നിലനിർത്തുമ്പോൾ എൻസൈമുകളുടെ പ്രവർത്തനത്തെ തടയുന്നതിനായി പിസിആർ ആണ് ആന്റിബോഡികൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്നത്.ഡീനാറ്ററേഷൻ സ്റ്റെപ്പിന്റെ 94 ℃ ഇൻസുലേഷൻ സമയത്ത് ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് പ്രതികരണത്തിലേക്ക് റിലീസ് ചെയ്തു, പൂർണ്ണ പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനം പുനഃസ്ഥാപിച്ചു.താപ സമാരംഭത്തിനായി രാസപരമായി പരിഷ്‌ക്കരിച്ച Taq DNA പോളിമറേസിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി, പോളിമറേസ് സജീവമാക്കുന്നതിന് പ്ലാറ്റിനം എൻസൈമിന് 94℃ (10 മുതൽ 15 മിനിറ്റ് വരെ) ദൈർഘ്യമുള്ള ഇൻസുലേഷൻ ആവശ്യമില്ല.PlatinumTaq DNA പോളിമറേസ് ഉപയോഗിച്ച്, Taq DNA പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനത്തിന്റെ 90% 2 മിനിറ്റിനുശേഷം 94℃-ൽ പുനഃസ്ഥാപിച്ചു.

ഫോറെസി എച്ച്എസ് ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ്

11. നെസ്റ്റ്-പിസിആർ

നെസ്റ്റഡ് പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് തുടർച്ചയായ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ റൗണ്ടുകൾ പ്രത്യേകതയും സംവേദനക്ഷമതയും മെച്ചപ്പെടുത്തും.ആദ്യ റൗണ്ട് 15 മുതൽ 20 വരെ സൈക്കിളുകളുടെ ഒരു സാധാരണ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനാണ്.പ്രാരംഭ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ ഒരു ചെറിയ ഭാഗം 100 മുതൽ 1000 തവണ വരെ നേർപ്പിച്ച് 15 മുതൽ 20 വരെ സൈക്കിളുകൾക്കുള്ള രണ്ടാം റൗണ്ട് ആംപ്ലിഫിക്കേഷനിൽ ചേർത്തു.പകരമായി, പ്രാരംഭ ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നം ജെൽ ശുദ്ധീകരണം വഴി വലിപ്പം ചെയ്യാം.ഒരു നെസ്റ്റഡ് പ്രൈമർ രണ്ടാം റൗണ്ട് ആംപ്ലിഫിക്കേഷനിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു, ഇത് ആദ്യ പ്രൈമറിനുള്ളിലെ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.നെസ്റ്റഡ് പിസിആറിന്റെ ഉപയോഗം ഒന്നിലധികം ടാർഗെറ്റ് സൈറ്റുകളുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന്റെ സാധ്യത കുറയ്ക്കുന്നു, കാരണം രണ്ട് സെറ്റ് പ്രൈമറുകൾക്കും പൂരകമായ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസുകൾ കുറവാണ്.ഒരേ പ്രൈമറുകളുള്ള അതേ സൈക്കിളുകളുടെ (30 മുതൽ 40 വരെ) വ്യക്തമല്ലാത്ത സൈറ്റുകളെ വർദ്ധിപ്പിച്ചു.നെസ്റ്റഡ് പിസിആർ പരിമിതമായ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസുകളുടെ സംവേദനക്ഷമത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു (ഉദാ, അപൂർവ mrnas) കൂടാതെ ബുദ്ധിമുട്ടുള്ള PCRS ന്റെ പ്രത്യേകത മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നു (ഉദാ: 5′ RACE).

12. അവരോഹണ പിസിആർ

പി‌സി‌ആറിന്റെ ആദ്യ കുറച്ച് സൈക്കിളുകൾക്ക് ഇറുകിയ അനീലിംഗ് അവസ്ഥകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഡിസെൻഡിംഗ് പി‌സി‌ആർ പ്രത്യേകത മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നു.കണക്കാക്കിയ Tm-നേക്കാൾ ഏകദേശം 5℃ ഉയർന്ന അനീലിംഗ് താപനിലയിൽ സൈക്കിൾ ആരംഭിക്കുന്നു, തുടർന്ന് അനീലിംഗ് താപനില Tm 5 ഡിഗ്രിയിൽ താഴെയാകുന്നതുവരെ ഓരോ സൈക്കിളും 1℃ മുതൽ 2℃ വരെ കുറയുന്നു.ഏറ്റവും ഉയർന്ന ഹോമോളജി ഉള്ള ഡെസ്റ്റിനേഷൻ ടെംപ്ലേറ്റ് മാത്രമേ വർദ്ധിപ്പിക്കൂ.ഈ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ തുടർന്നുള്ള സൈക്കിളുകളിൽ വികസിക്കുന്നത് തുടരുന്നു, ആംപ്ലിഫൈഡ് നോൺസ്‌പെസിഫിക് ഉൽപ്പന്നങ്ങളെ പുറന്തള്ളുന്നു.AFLP DNA വിരലടയാളം പോലെ, പ്രൈമറിനും ടാർഗെറ്റ് ടെംപ്ലേറ്റിനും ഇടയിലുള്ള ഹോമോളജിയുടെ അളവ് അറിയാത്ത രീതികൾക്ക് ഡിസെൻഡിംഗ് PCR ഉപയോഗപ്രദമാണ്.

ബന്ധപ്പെട്ട PCR കിറ്റുകൾ

 പിസിആർ ഈസി (ഡൈ ഉപയോഗിച്ച്)

2× PCR ഹീറോ^TMസാധാരണ പിസിആർ മിക്സ് സിസ്റ്റത്തേക്കാൾ പിസിആർ ഇൻഹിബിറ്ററുകളോട് മിക്സ് സിസ്റ്റത്തിന് ഉയർന്ന സഹിഷ്ണുതയുണ്ട്, കൂടാതെ വിവിധ സങ്കീർണ്ണമായ ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെ പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനെ എളുപ്പത്തിൽ നേരിടാനും കഴിയും.അതുല്യമായ പ്രതികരണ സംവിധാനവും ഉയർന്ന ദക്ഷതയുള്ള ടാക്ക് ഹീറോയും PCR പ്രതികരണത്തിന് ഉയർന്ന ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയും പ്രത്യേകതയും സംവേദനക്ഷമതയും ഉള്ളതാക്കുന്നു.

 PCR Heroᴹ (ഡൈ ഉപയോഗിച്ച്)

ഉയർന്ന ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത

ഇതിന് 5'→3' ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനവും 3'→5' എക്‌സോന്യൂക്ലീസ് ആക്‌റ്റിവിറ്റി കൂടാതെ 5'→3' എക്‌സോന്യൂക്ലീസ് പ്രവർത്തനവുമുണ്ട്.

റിയൽ ടൈം PCR Easyᴹ-SYBR ഗ്രീൻ ഐ കിറ്റ്

നിർദ്ദിഷ്ട-ഒപ്റ്റിമൈസ്ഡ് ബഫറും ഹോട്ട്-സ്റ്റാർട്ട് ടാക്ക് എൻസൈമും നോൺ-സ്പെസിഫിക്കേഷൻ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും പ്രൈമർ ഡൈമർ രൂപീകരണവും തടയും

ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമത-ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ കുറഞ്ഞ പകർപ്പുകൾ കണ്ടെത്താനാകും

RT-PCR എളുപ്പം I(ഒരു ഘട്ടം)

പ്രതികരണത്തിന്റെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയും പ്രത്യേകതയും ഫലപ്രദമായി മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനായി കിറ്റ് ഒരു അദ്വിതീയ ഫോർജീൻ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിയാജന്റും ഫോർജീൻ ഹോട്ട്സ്റ്റാർ ടാക്ക് ഡിഎൻഎ പോളിമറേസും ഒരു അദ്വിതീയ പ്രതികരണ സംവിധാനവും ഉപയോഗിക്കുന്നു.