一, പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിന്റെ സംവേദനക്ഷമത വർദ്ധിപ്പിക്കുക:

1. ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള RNA വേർതിരിച്ചെടുക്കുക:

വിജയകരമായ cDNA സിന്തസിസ് ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള RNA-യിൽ നിന്നാണ്.ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള RNA കുറഞ്ഞത് മുഴുനീളവും EDTA അല്ലെങ്കിൽ SDS പോലുള്ള റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ഇല്ലാത്തതും ആയിരിക്കണം.ആർ‌എൻ‌എയുടെ ഗുണനിലവാരം നിങ്ങൾക്ക് സിഡി‌എൻ‌എയിലേക്ക് ട്രാൻസ്‌ക്രൈബുചെയ്യാനാകുന്ന സീക്വൻസ് വിവരങ്ങളുടെ പരമാവധി അളവ് നിർണ്ണയിക്കുന്നു.ഗ്വാനിഡിൻ ഐസോത്തിയോസയനേറ്റ്/ആസിഡ് ഫിനോൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഒറ്റ-ഘട്ട രീതിയാണ് സാധാരണ ആർഎൻഎ ശുദ്ധീകരണ രീതി.RNase ന്റെ അളവ് മൂലമുള്ള മലിനീകരണം തടയുന്നതിന്, RNase-സമ്പന്ന സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത RNA (പാൻക്രിയാസ് പോലുള്ളവ) ഫോർമാൽഡിഹൈഡിൽ സൂക്ഷിക്കേണ്ടതുണ്ട്, ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള RNA, പ്രത്യേകിച്ച് ദീർഘകാല സംഭരണത്തിനായി.എലിയുടെ കരളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ആർ‌എൻ‌എ അടിസ്ഥാനപരമായി ഒരാഴ്ച വെള്ളത്തിൽ സംഭരിച്ചതിന് ശേഷം നശിപ്പിച്ചു, അതേസമയം എലിയുടെ പ്ലീഹയിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ആർ‌എൻ‌എ 3 വർഷത്തേക്ക് വെള്ളത്തിൽ സംഭരിച്ചതിന് ശേഷവും സ്ഥിരത നിലനിർത്തി.കൂടാതെ, 4 kb-ൽ കൂടുതൽ ദൈർഘ്യമുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ ചെറിയ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളേക്കാൾ ട്രെയ്സ് RNases വഴിയുള്ള ഡീഗ്രേഡേഷനോട് കൂടുതൽ സെൻസിറ്റീവ് ആണ്.സംഭരിച്ച ആർഎൻഎ സാമ്പിളുകളുടെ സ്ഥിരത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന്, ആർഎൻഎ ഡീയോണൈസ്ഡ് ഫോർമൈഡിൽ ലയിപ്പിച്ച് -70 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സൂക്ഷിക്കാം.ആർഎൻഎയെ സംരക്ഷിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഫോർമാമൈഡ് ആർഎൻഎയെ നശിപ്പിക്കുന്ന അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ നിന്ന് മുക്തമായിരിക്കണം.പാൻക്രിയാസിൽ നിന്നുള്ള ആർഎൻഎ കുറഞ്ഞത് ഒരു വർഷമെങ്കിലും ഫോർമൈഡിൽ സൂക്ഷിക്കാം.ആർഎൻഎ ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് തയ്യാറെടുക്കുമ്പോൾ, ആർഎൻഎയെ പ്രേരിപ്പിക്കാൻ നിങ്ങൾക്ക് ഇനിപ്പറയുന്ന രീതി ഉപയോഗിക്കാം: NaCl 0.2M ലേക്ക് ചേർക്കുകയും എത്തനോളിന്റെ 4 മടങ്ങ് വോളിയവും ചേർക്കുക, 3-5 മിനിറ്റ് ഊഷ്മാവിൽ വയ്ക്കുക, 5 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 10,000×g-ൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ്.

2. RNaseH-inactive (RNaseH-) റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ഉപയോഗിക്കുക:

cDNA സിന്തസിസിന്റെ ദൈർഘ്യവും വിളവും വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനായി RNase ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ പലപ്പോഴും റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രതികരണങ്ങളിൽ ചേർക്കുന്നു.ഒരു ബഫറിന്റെയും ഒരു റിഡ്യൂസിംഗ് ഏജന്റിന്റെയും (ഡിടിടി പോലുള്ളവ) സാന്നിധ്യത്തിൽ ആദ്യ സ്ട്രാൻഡ് സിന്തസിസ് പ്രതികരണ സമയത്ത് RNase ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ചേർക്കണം, കാരണം cDNA സിന്തസിസിന് മുമ്പുള്ള പ്രക്രിയ ഇൻഹിബിറ്ററിനെ ഇല്ലാതാക്കുന്നു, അതുവഴി ആർഎൻഎയെ തരംതാഴ്ത്താൻ കഴിയുന്ന ബൗണ്ട് RNase പുറത്തുവിടുന്നു.പ്രോട്ടീൻ RNase ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ RNase A, B, C വഴി RNA യുടെ ഡീഗ്രേഡേഷൻ തടയുന്നു, ചർമ്മത്തിൽ RNase തടയരുത്, അതിനാൽ ഈ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ചിട്ടും നിങ്ങളുടെ വിരലുകളിൽ നിന്ന് RNase അവതരിപ്പിക്കാതിരിക്കാൻ ശ്രദ്ധിക്കുക.

റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ആർഎൻഎയെ സിഡിഎൻഎയിലേക്കുള്ള പരിവർത്തനത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു.M-MLV, AMV എന്നിവയ്‌ക്ക് സ്വന്തം പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനത്തിന് പുറമേ എൻഡോജെനസ് RNaseH പ്രവർത്തനവുമുണ്ട്.RNaseH പ്രവർത്തനവും പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനവും RNA ടെംപ്ലേറ്റിനും DNA പ്രൈമറിനും അല്ലെങ്കിൽ cDNA എക്സ്റ്റൻഷൻ സ്‌ട്രാൻഡിനും ഇടയിൽ രൂപപ്പെടുന്ന ഹൈബ്രിഡ് സ്‌ട്രാൻഡിനായി പരസ്പരം മത്സരിക്കുകയും RNA:DNA കോംപ്ലക്സിലെ RNA സ്‌ട്രാൻഡിനെ തരംതാഴ്ത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.RNaseH പ്രവർത്തനത്താൽ തരംതാഴ്ത്തപ്പെട്ട ആർഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റിന് സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസിന്റെ ഫലപ്രദമായ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റായി പ്രവർത്തിക്കാൻ കഴിയില്ല, ഇത് സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസിന്റെ വിളവും ദൈർഘ്യവും കുറയ്ക്കുന്നു.അതിനാൽ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിന്റെ RNaseH പ്രവർത്തനം ഇല്ലാതാക്കുകയോ ഗണ്യമായി കുറയ്ക്കുകയോ ചെയ്യുന്നത് പ്രയോജനകരമായിരിക്കും.

സൂപ്പർസ്ക്രിപ്റ്റ് Ⅱ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്, RNaseH- MMLV റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്, തെർമോസ്ക്രിപ്റ്റ് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്, RNaseH- AMV എന്നിവയ്ക്ക് MMLV, AMV എന്നിവയേക്കാൾ കൂടുതൽ തുകയും കൂടുതൽ ദൈർഘ്യമുള്ള cDNA ലഭിക്കും.സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസിന്റെ അളവ് ആർടി-പിസിആർ സംവേദനക്ഷമതയെ ബാധിക്കും.തെർമോസ്ക്രിപ്റ്റ് എഎംവിയേക്കാൾ വളരെ സെൻസിറ്റീവ് ആണ്.RT-PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ വലിപ്പം cDNA സമന്വയിപ്പിക്കാനുള്ള റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിന്റെ കഴിവ് പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു, പ്രത്യേകിച്ച് വലിയ cDNA-കൾ ക്ലോണുചെയ്യുമ്പോൾ.MMLV-യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, SuperScripⅡ ദൈർഘ്യമേറിയ RT-PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ വിളവ് ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചു.RNaseH-റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിന് തെർമോസ്റ്റബിലിറ്റി വർദ്ധിപ്പിച്ചിട്ടുണ്ട്, അതിനാൽ സാധാരണ 37-42 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിനേക്കാൾ ഉയർന്ന താപനിലയിൽ പ്രതികരണം നടത്താം.നിർദ്ദേശിച്ചിരിക്കുന്ന സിന്തസിസ് വ്യവസ്ഥകളിൽ, ഒലിഗോ(dT) പ്രൈമറും [α-P]dCTP യുടെ 10 μCi ഉം ഉപയോഗിക്കുക.TCA മഴയുടെ രീതി ഉപയോഗിച്ചാണ് ആദ്യ സ്‌ട്രാൻഡിന്റെ ആകെ വിളവ് കണക്കാക്കിയത്.പൂർണ്ണ ദൈർഘ്യമുള്ള സിഡിഎൻഎ എക്സൈസ് ചെയ്തതും ആൽക്കലൈൻ അഗറോസ് ജെല്ലിൽ കണക്കാക്കിയതുമായ വലുപ്പം ക്രമീകരിച്ച ബാൻഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു.

3. റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനായി ഇൻകുബേഷൻ താപനില ഉയർത്തുക:

ഉയർന്ന ഇൻകുബേഷൻ താപനില RNA ദ്വിതീയ ഘടന തുറക്കാൻ സഹായിക്കുന്നു, പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന്റെ വിളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു.മിക്ക RNA ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്കും, ബഫറോ ഉപ്പോ ഇല്ലാതെ 65 ° C താപനിലയിൽ RNA, പ്രൈമറുകൾ എന്നിവ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുന്നു, തുടർന്ന് ഐസിൽ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള തണുപ്പിക്കൽ മിക്ക ദ്വിതീയ ഘടനകളെയും ഇല്ലാതാക്കുകയും പ്രൈമറുകൾ ബന്ധിപ്പിക്കാൻ അനുവദിക്കുകയും ചെയ്യും.എന്നിരുന്നാലും, ചില ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്ക് ഇപ്പോഴും ദ്വിതീയ ഘടനയുണ്ട്, ചൂട് ഡീനാറ്ററേഷനു ശേഷവും.ഈ ദുഷ്‌കരമായ ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ തെർമോസ്‌ക്രിപ്റ്റ് റിവേഴ്‌സ് ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്‌റ്റേസ് ഉപയോഗിച്ച് നടത്താനും ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിന് റിവേഴ്‌സ് ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്ഷൻ പ്രതികരണം ഉയർന്ന താപനിലയിൽ സ്ഥാപിക്കാനും കഴിയും.ഉയർന്ന ഇൻകുബേഷൻ താപനിലയും പ്രത്യേകത വർദ്ധിപ്പിക്കും, പ്രത്യേകിച്ചും സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസിനായി ജീൻ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ (ജിഎസ്പി) ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ (അധ്യായം 3 കാണുക).GSP ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ, പ്രൈമറുകളുടെ Tm പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന ഇൻകുബേഷൻ താപനിലയ്ക്ക് തുല്യമാണെന്ന് ഉറപ്പാക്കുക.60°C ന് മുകളിലുള്ള ഒലിഗോ(dT), റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ എന്നിവ ഉപയോഗിക്കരുത്.റാൻഡം പ്രൈമറുകൾക്ക് 60 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലേക്ക് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് 10 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 25 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേഷൻ ആവശ്യമാണ്.ഉയർന്ന റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ടെമ്പറേച്ചർ ഉപയോഗിക്കുന്നതിനു പുറമേ, ആർഎൻഎ/പ്രൈമർ മിക്സ് 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ് ഡിനാറ്ററേഷൻ താപനിലയിൽ നിന്ന് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഇൻകുബേഷൻ ടെമ്പറേച്ചറിലേക്ക് നേരിട്ട് കൈമാറ്റം ചെയ്യുന്നതിലൂടെയും പ്രീ-വാംഡ് 2× റിയാക്ഷൻ മിശ്രിതം (സിഡിഎൻഎ ഹോട്ട്-സ്റ്റാർട്ട് സിന്തസിസ്) ചേർക്കുകയും ചെയ്യുന്നതിലൂടെയും പ്രത്യേകത മെച്ചപ്പെടുത്താം.താഴ്ന്ന ഊഷ്മാവിൽ സംഭവിക്കുന്ന ഇന്റർമോളികുലാർ ബേസ് ജോടിയാക്കൽ തടയാൻ ഈ സമീപനം സഹായിക്കുന്നു.RT-PCR-ന് ആവശ്യമായ ഒന്നിലധികം താപനില സ്വിച്ചിംഗ് ഒരു തെർമൽ സൈക്ലർ ഉപയോഗിച്ച് ലളിതമാക്കാം.

Tth തെർമോസ്റ്റബിൾ പോളിമറേസ് Mg2+ ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ DNA പോളിമറേസ് ആയും Mn2+ ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ RNA പോളിമറേസ് ആയും പ്രവർത്തിക്കുന്നു.പരമാവധി 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ചൂടാക്കി സൂക്ഷിക്കാം.എന്നിരുന്നാലും, PCR സമയത്ത് Mn2+ ന്റെ സാന്നിധ്യം വിശ്വാസ്യത കുറയ്ക്കുന്നു, ഇത് cDNA ക്ലോണിംഗ് പോലെയുള്ള ഉയർന്ന കൃത്യതയുള്ള ആംപ്ലിഫിക്കേഷന് Tth പോളിമറേസിനെ അനുയോജ്യമാക്കുന്നില്ല.കൂടാതെ, Tth ന് കുറഞ്ഞ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ കാര്യക്ഷമതയുണ്ട്, ഇത് സംവേദനക്ഷമത കുറയ്ക്കുന്നു, കൂടാതെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും പിസിആറും ഒരൊറ്റ എൻസൈം ഉപയോഗിച്ച് നടത്താൻ കഴിയുമെന്നതിനാൽ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഇല്ലാതെയുള്ള നിയന്ത്രണ പ്രതികരണങ്ങൾ cDNA ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങളെ മലിനമാക്കുന്ന ജനിതക ഡിഎൻഎയുമായി താരതമ്യം ചെയ്യാൻ കഴിയില്ല.ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ വേർതിരിച്ചു.

4. റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്ന അഡിറ്റീവുകൾ:

ഗ്ലിസറോളും ഡിഎംഎസ്ഒയും ഉൾപ്പെടെയുള്ള അഡിറ്റീവുകൾ ഫസ്റ്റ്-സ്ട്രാൻഡ് സിന്തസിസ് റിയാക്ഷനിൽ ചേർക്കുന്നു, ഇത് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഡബിൾ-സ്ട്രാൻഡിന്റെ സ്ഥിരത കുറയ്ക്കുകയും ആർഎൻഎയുടെ ദ്വിതീയ ഘടനയെ അഴിച്ചുമാറ്റുകയും ചെയ്യും.SuperScript II അല്ലെങ്കിൽ MMLV പ്രവർത്തനത്തെ ബാധിക്കാതെ 20% ഗ്ലിസറോൾ അല്ലെങ്കിൽ 10% DMSO ചേർക്കാവുന്നതാണ്.എഎംവിക്ക് 20% ഗ്ലിസറോൾ വരെ പ്രവർത്തനം നഷ്ടപ്പെടാതെ സഹിക്കും.സൂപ്പർസ്ക്രിപ്റ്റ്Ⅱ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിയാക്ഷനിൽ RT-PCR-ന്റെ സംവേദനക്ഷമത പരമാവധി വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന്, 10% ഗ്ലിസറോൾ ചേർത്ത് 45°C താപനിലയിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യാം.പിസിആറിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിയാക്ഷൻ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ 1/10 ചേർത്താൽ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ റിയാക്ഷനിൽ ഗ്ലിസറോളിന്റെ സാന്ദ്രത 0.4% ആണ്, ഇത് പിസിആറിനെ തടയാൻ പര്യാപ്തമല്ല.

5. RNaseH ചികിത്സ:

PCR-ന് മുമ്പുള്ള RNaseH ഉപയോഗിച്ചുള്ള cDNA സിന്തസിസ് പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളുടെ ചികിത്സ സെൻസിറ്റിവിറ്റി വർദ്ധിപ്പിക്കും.ചില ടെംപ്ലേറ്റുകൾക്ക്, സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസ് പ്രതികരണത്തിലെ ആർഎൻഎ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ബൈൻഡിംഗിനെ തടയുന്നു, ഈ സാഹചര്യത്തിൽ RNaseH ചികിത്സയ്ക്ക് സെൻസിറ്റിവിറ്റി വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.സാധാരണയായി, ലോ-കോപ്പി ട്യൂബറസ് ഷെറോസിസ് II പോലെയുള്ള ദൈർഘ്യമേറിയ പൂർണ്ണ ദൈർഘ്യമുള്ള cDNA ടാർഗെറ്റ് ടെംപ്ലേറ്റുകൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുമ്പോൾ RNaseH ചികിത്സ ആവശ്യമാണ്.ഈ ബുദ്ധിമുട്ടുള്ള ടെംപ്ലേറ്റിനായി, സൂപ്പർസ്ക്രിപ്റ്റ് II അല്ലെങ്കിൽ AMV-സിന്തസൈസ്ഡ് cDNA നിർമ്മിച്ച സിഗ്നൽ RNaseH ചികിത്സ മെച്ചപ്പെടുത്തി.മിക്ക RT-PCR പ്രതികരണങ്ങൾക്കും, RNaseH ചികിത്സ ഓപ്ഷണൽ ആണ്, കാരണം 95°C ലെ PCR denaturation ഘട്ടം RNA:DNA കോംപ്ലക്സിലെ RNAയെ ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യുന്നു.

6. ചെറിയ ആർഎൻഎ കണ്ടെത്തൽ രീതി മെച്ചപ്പെടുത്തൽ:

ആർ‌എൻ‌എയുടെ ചെറിയ അളവിൽ മാത്രം ലഭ്യമാകുമ്പോൾ ആർ‌ടി-പി‌സി‌ആർ പ്രത്യേകിച്ചും വെല്ലുവിളി നിറഞ്ഞതാണ്.ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷൻ സമയത്ത് ഒരു കാരിയർ ആയി ചേർക്കുന്ന ഗ്ലൈക്കോജൻ ചെറിയ സാമ്പിളുകളുടെ വിളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ സഹായിക്കുന്നു.ട്രൈസോൾ ചേർക്കുന്ന അതേ സമയം RNase-free glycogen ചേർക്കാവുന്നതാണ്.ഗ്ലൈക്കോജൻ വെള്ളത്തിൽ ലയിക്കുന്നതാണ്, തുടർന്നുള്ള മഴയെ സഹായിക്കാൻ ആർഎൻഎയോടൊപ്പം ജലീയ ഘട്ടത്തിൽ സൂക്ഷിക്കാം.50 മില്ലിഗ്രാമിൽ താഴെയുള്ള ടിഷ്യൂ അല്ലെങ്കിൽ 106 കൾച്ചർഡ് സെല്ലുകളിൽ താഴെയുള്ള സാമ്പിളുകൾക്ക്, RNase-ഫ്രീ ഗ്ലൈക്കോജന്റെ ശുപാർശിത സാന്ദ്രത 250 μg/ml ആണ്.

സൂപ്പർസ്ക്രിപ്റ്റ് II ഉപയോഗിച്ചുള്ള റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിയാക്ഷനിൽ അസറ്റിലേറ്റഡ് ബിഎസ്എ ചേർക്കുന്നത് സെൻസിറ്റിവിറ്റി വർദ്ധിപ്പിക്കും, കൂടാതെ ചെറിയ അളവിലുള്ള ആർഎൻഎയ്ക്ക് സൂപ്പർസ്ക്രിപ്റ്റ് II ന്റെ അളവ് കുറയ്ക്കുകയും 40 യൂണിറ്റ് RNaseOut ന്യൂക്ലീസ് ഇൻഹിബിറ്റർ ചേർക്കുകയും ചെയ്യുന്നത് കണ്ടെത്തൽ നില വർദ്ധിപ്പിക്കും.ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷൻ പ്രക്രിയയിൽ ഗ്ലൈക്കോജൻ ഉപയോഗിക്കുന്നുണ്ടെങ്കിൽ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിയാക്ഷനായി സൂപ്പർസ്ക്രിപ്റ്റ് II ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ ബിഎസ്എ അല്ലെങ്കിൽ ആർനേസ് ഇൻഹിബിറ്റർ ചേർക്കുന്നത് ഇപ്പോഴും ശുപാർശ ചെയ്യപ്പെടുന്നു.

二, RT-PCR പ്രത്യേകത വർദ്ധിപ്പിക്കുക

1. CND അസിന്തസിസ്:

മൂന്ന് വ്യത്യസ്‌ത രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് ഫസ്റ്റ്-സ്‌ട്രാൻഡ് സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസ് ആരംഭിക്കാൻ കഴിയും, ഇതിന്റെ ആപേക്ഷിക പ്രത്യേകത സിഡിഎൻഎ സിന്തസൈസ് ചെയ്‌ത അളവിനെയും തരത്തെയും ബാധിക്കുന്നു.

റാൻഡം പ്രൈമർ രീതിയാണ് മൂന്ന് രീതികളിൽ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞത്.ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്‌റ്റിലുടനീളം ഒന്നിലധികം സൈറ്റുകളിൽ പ്രൈമറുകൾ അനിയൽ ചെയ്യുന്നു, ഹ്രസ്വവും ഭാഗിക ദൈർഘ്യമുള്ളതുമായ സിഡിഎൻഎകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നു.ഈ രീതി 5′ എൻഡ് സീക്വൻസുകൾ നേടുന്നതിനും ദ്വിതീയ ഘടനയുടെ പ്രദേശങ്ങളുള്ള ആർഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റുകളിൽ നിന്നോ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് വഴി പകർത്താൻ കഴിയാത്ത ടെർമിനേഷൻ സൈറ്റുകളിൽ നിന്നോ സിഡിഎൻഎ നേടുന്നതിനും പതിവായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഏറ്റവും ദൈർഘ്യമേറിയ സിഡിഎൻഎ ലഭിക്കുന്നതിന്, ഓരോ ആർഎൻഎ സാമ്പിളിലെയും പ്രൈമറുകളുടെയും ആർഎൻഎയുടെയും അനുപാതം അനുഭവപരമായി നിർണ്ണയിക്കേണ്ടതുണ്ട്.റാൻഡം പ്രൈമറുകളുടെ ആരംഭ സാന്ദ്രത 20 μl പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന് 50 മുതൽ 250 ng വരെയാണ്.റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് മൊത്തം ആർഎൻഎയിൽ നിന്ന് സിഡിഎൻഎ സമന്വയിപ്പിക്കപ്പെടുന്നത് പ്രാഥമികമായി റൈബോസോമൽ ആർഎൻഎ ആയതിനാൽ, പോളി(എ)+ആർഎൻഎയാണ് പൊതുവെ ടെംപ്ലേറ്റായി തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നത്.

ഒലിഗോ(ഡിടി) പ്രൈമറുകൾ റാൻഡം പ്രൈമറുകളേക്കാൾ കൂടുതൽ നിർദ്ദിഷ്ടമാണ്.മിക്ക യൂക്കറിയോട്ടിക് എംആർഎൻഎകളുടെയും 3′ അറ്റത്ത് കാണപ്പെടുന്ന പോളി(എ) വാലിലേക്ക് ഇത് സങ്കരീകരിക്കുന്നു.പോളി(എ)+ ആർഎൻഎ മൊത്തം ആർഎൻഎയുടെ ഏകദേശം 1% മുതൽ 2% വരെ ആയതിനാൽ, cDNA യുടെ അളവും സങ്കീർണ്ണതയും റാൻഡം പ്രൈമറുകളേക്കാൾ വളരെ കുറവാണ്.ഉയർന്ന പ്രത്യേകത കാരണം, ഒലിഗോ(dT) ന് പൊതുവെ ആർഎൻഎയും പ്രൈമറുകളും പോളി(എ)+ തിരഞ്ഞെടുപ്പും തമ്മിലുള്ള അനുപാതം ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ ആവശ്യമില്ല.20μl പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിൽ 0.5μg ഒലിഗോ (dT) ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.ഒലിഗോ(dT)12-18 മിക്ക RT-PCR-നും അനുയോജ്യമാണ്.തെർമോസ്ക്രിപ്റ്റ് RT-PCR സിസ്റ്റം ഒലിഗോ(dT)20 വാഗ്ദാനം ചെയ്യുന്നു, കാരണം ഉയർന്ന ഇൻകുബേഷൻ താപനിലയ്ക്ക് മികച്ച താപ സ്ഥിരത.

ജീൻ നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ (GSP) റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സ്റ്റെപ്പിനുള്ള ഏറ്റവും നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകളാണ്.ജിഎസ്പി ഒരു ആന്റിസെൻസ് ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡാണ്, അത് റാൻഡം പ്രൈമറുകളിൽ നിന്നോ ഒലിഗോ (ഡിടി) പോലെയോ വ്യത്യസ്തമായി ആർഎൻഎ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസിലേക്ക് പ്രത്യേകമായി ഹൈബ്രിഡൈസ് ചെയ്യാൻ കഴിയും.പിസിആർ പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന അതേ നിയമങ്ങൾ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രതികരണങ്ങളിലെ ജിഎസ്പിയുടെ രൂപകൽപ്പനയ്ക്കും ബാധകമാണ്.എംആർഎൻഎയുടെ 3′-ഏറ്റവും അറ്റം വരെ അനെൽ ചെയ്യുന്ന ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രൈമറിന്റെ അതേ സീക്വൻസാണ് ജിഎസ്പി, അല്ലെങ്കിൽ റിവേഴ്‌സ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രൈമറിന്റെ താഴേയ്‌ക്ക് അനീൽ ചെയ്യാൻ ജിഎസ്പി രൂപകൽപ്പന ചെയ്‌തേക്കാം.ചില ആംപ്ലിഫൈഡ് സബ്ജക്റ്റുകൾക്ക്, വിജയകരമായ RT-PCR-നായി ഒന്നിലധികം ആന്റിസെൻസ് പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യേണ്ടതുണ്ട്, കാരണം ടാർഗെറ്റ് ആർഎൻഎയുടെ ദ്വിതീയ ഘടന പ്രൈമർ ബൈൻഡിംഗിനെ തടഞ്ഞേക്കാം.20 μl ഫസ്റ്റ്-സ്ട്രാൻഡ് സിന്തസിസ് പ്രതികരണത്തിൽ 1 pmol ആന്റിസെൻസ് GSP ഉപയോഗിക്കാൻ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

2. റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനായി ഇൻകുബേഷൻ താപനില ഉയർത്തുക:

GSP സ്പെസിഫിസിറ്റിയുടെ പൂർണ്ണമായ പ്രയോജനം ലഭിക്കുന്നതിന്, ഉയർന്ന തെർമോസ്റ്റബിലിറ്റി ഉള്ള ഒരു റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ഉപയോഗിക്കണം.തെർമോസ്റ്റബിൾ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസുകൾ ഉയർന്ന ഊഷ്മാവിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത് പ്രതിപ്രവർത്തന തീവ്രത വർദ്ധിപ്പിക്കും.ഉദാഹരണത്തിന്, ഒരു ജിഎസ്പി 55 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ വർധിച്ചാൽ, 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനായി എഎംവി അല്ലെങ്കിൽ എം-എംഎൽവി ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ, ജിഎസ്പിയുടെ പ്രത്യേകത പൂർണ്ണമായും ഉപയോഗിക്കപ്പെടില്ല.എന്നിരുന്നാലും, സൂപ്പർസ്‌ക്രിപ്റ്റ് II, തെർമോസ്‌ക്രിപ്റ്റ് എന്നിവ 50 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലോ അതിൽ കൂടുതലോ പ്രതികരിക്കാം, ഇത് കുറഞ്ഞ താപനിലയിൽ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്ന നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളെ ഇല്ലാതാക്കും.പരമാവധി പ്രത്യേകതയ്ക്കായി, ആർഎൻഎ/പ്രൈമർ മിശ്രിതം 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ് ഡിനാറ്ററേഷൻ താപനിലയിൽ നിന്ന് നേരിട്ട് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഇൻകുബേഷൻ ടെമ്പറേച്ചറിലേക്ക് മാറ്റുകയും പ്രീ-വാംഡ് 2× റിയാക്ഷൻ മിക്സിലേക്ക് (cDNA സിന്തസിസ് ഹോട്ട് സ്റ്റാർട്ട്) ചേർക്കുകയും ചെയ്യാം.കുറഞ്ഞ താപനിലയിൽ ഇന്റർമോളിക്യുലാർ ബേസ് ജോടിയാക്കുന്നത് തടയാൻ ഇത് സഹായിക്കുന്നു.RT-PCR-ന് ആവശ്യമായ ഒന്നിലധികം താപനില സംക്രമണങ്ങൾ ഒരു തെർമൽ സൈക്ലർ ഉപയോഗിച്ച് ലളിതമാക്കാം.

3. ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ മലിനീകരണം കുറയ്ക്കുന്നു

ആർ‌ടി-പി‌സി‌ആറിന് അഭിമുഖീകരിക്കാവുന്ന ഒരു ബുദ്ധിമുട്ട് ആർ‌എൻ‌എയിലെ ജീനോമിക് ഡി‌എൻ‌എയുടെ മലിനീകരണമാണ്.ട്രൈസോൾ റീജന്റ് പോലെയുള്ള നല്ലൊരു ആർഎൻഎ ഐസൊലേഷൻ രീതി ഉപയോഗിക്കുന്നത്, ആർഎൻഎ തയ്യാറാക്കലിനെ മലിനമാക്കുന്ന ജനിതക ഡിഎൻഎയുടെ അളവ് കുറയ്ക്കും.ജീനോമിക് ഡിഎൻഎയിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ഒഴിവാക്കാൻ, റിവേഴ്‌സ് ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്ഷന് മുമ്പ് മലിനമാക്കുന്ന ഡിഎൻഎ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി ആർഎൻഎയെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ-ഗ്രേഡ് ഡിനേസ് I ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കാം.സാമ്പിളുകൾ 2.0 എംഎം ഇഡിടിഎയിൽ 10 മിനിറ്റ് 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട് ഡിനേസ് I ദഹനം അവസാനിപ്പിച്ചു.ഉയർന്ന ഊഷ്മാവിൽ മഗ്നീഷ്യം അയോണിനെ ആശ്രയിച്ചുള്ള ആർഎൻഎ ജലവിശ്ലേഷണത്തെ തടയുന്ന മഗ്നീഷ്യം അയോണുകളെ EDTA യ്ക്ക് ചേലേറ്റ് ചെയ്യാൻ കഴിയും.

മലിനമാക്കുന്ന ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങളിൽ നിന്ന് ആംപ്ലിഫൈഡ് സിഡിഎൻഎ വേർതിരിക്കുന്നതിന്, പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപന ചെയ്യാൻ കഴിയും, അവ ഓരോന്നും എക്സോണുകളെ വേർതിരിക്കുന്നു.സിഡിഎൻഎയിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ മലിനമായ ജീനോമിക് ഡിഎൻഎയിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞതിനേക്കാൾ ചെറുതായിരിക്കും.കൂടാതെ, ഓരോ ആർഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റിലും റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഇല്ലാതെ ഒരു നിയന്ത്രണ പരീക്ഷണം നടത്തി, നൽകിയ ശകലം ജനിതക ഡിഎൻഎയിൽ നിന്നോ സിഡിഎൻഎയിൽ നിന്നോ ഉരുത്തിരിഞ്ഞതാണോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ.റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഇല്ലാതെ ലഭിക്കുന്ന PCR ഉൽപ്പന്നം ജീനോമിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞതാണ്.