ഔപചാരിക പരീക്ഷണങ്ങളുടെ സുഗമമായ പുരോഗതി ഉറപ്പാക്കുന്നതിന് പിസിആർ റിയാക്ടറുകളുടെ പ്രാരംഭ ഘട്ടത്തിൽ പ്രൈമറുകളുടെയും പേടകങ്ങളുടെയും പ്രകടനം പരിശോധിക്കുന്നതും ഏറ്റവും അനുയോജ്യമായ പ്രതികരണ സാഹചര്യങ്ങൾ നിർണ്ണയിക്കുന്നതും മുൻവ്യവസ്ഥകളാണ്.
ആദ്യഘട്ടത്തിൽ പ്രൈമർ അന്വേഷണം എങ്ങനെ സ്ഥിരീകരിക്കണം?
ബേസ്ലൈൻ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ്, സിടി മൂല്യം, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത, കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയുള്ള സാമ്പിൾ ഡിറ്റക്ഷൻ, സിവി മുതലായവയാണ് പ്രധാന സൂചകങ്ങൾ.
അടിസ്ഥാനരേഖ
പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവിലെ തിരശ്ചീന രേഖയാണ് അടിസ്ഥാനരേഖ.പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രതികരണത്തിന്റെ ആദ്യ കുറച്ച് സൈക്കിളുകളിൽ, ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നൽ വലിയ മാറ്റമൊന്നും വരുത്താതെ ഒരു നേർരേഖ ഉണ്ടാക്കുന്നു.ഈ നേർരേഖയാണ് അടിസ്ഥാനരേഖ.
പിസിആർ പ്രൈമർ പ്രോബുകൾ സ്ക്രീൻ ചെയ്യുമ്പോൾ, ബേസ്ലൈൻ ലെവലാണോ എന്ന് ശ്രദ്ധിക്കുക.പ്രൈമർ പ്രോബ് കോൺസൺട്രേഷന്റെ പരിശുദ്ധി അടിസ്ഥാനരേഖയെ ബാധിക്കും, അതായത് ബേസ്ലൈൻ ഉയരുകയോ താഴുകയോ ചെയ്യുന്നത്.അടിസ്ഥാനരേഖയും വളരെ അവബോധജന്യമായ ഒരു സൂചകമാണ്.
ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവ്
ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവിന്റെ ആകൃതിയാണ് മറ്റൊരു അവബോധ സൂചകം.ദ്വിതീയ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനോ മറ്റ് അസാധാരണ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവുകളോ ഒഴിവാക്കാൻ എസ് ആകൃതിയിലുള്ള വക്രം ഉണ്ടായിരിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.
Ct മൂല്യം
ബേസ്ലൈൻ മുതൽ എക്സ്പോണൻഷ്യൽ വളർച്ച വരെയുള്ള ഇൻഫ്ളക്ഷൻ പോയിന്റുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം Ct മൂല്യമാണ്.
ഒരേ സാമ്പിളിനായി, വ്യത്യസ്ത പ്രൈമർ പ്രോബുകൾ വ്യത്യസ്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കർവുകൾക്ക് കാരണമാകുന്നു, കൂടാതെ അനുബന്ധ സിടി മൂല്യത്തെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയും ഇടപെടലിന്റെ അളവും ബാധിക്കും.സിദ്ധാന്തത്തിൽ, നമ്മൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്ന പ്രൈമർ പ്രോബിന്റെ Ct മൂല്യം എത്ര ചെറുതാണോ അത്രയും നല്ലത്.
ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത
പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത വിലയിരുത്തുന്നതിനുള്ള ഏറ്റവും വിശ്വസനീയവും സുസ്ഥിരവുമായ രീതികളിലൊന്നാണ് സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ്, ഇത് ഗവേഷകർ വ്യാപകമായി അംഗീകരിക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.ടാർഗെറ്റ് ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെ ആപേക്ഷിക എണ്ണം നിയന്ത്രിക്കുന്നതിന് സാമ്പിളുകളുടെ ഒരു പരമ്പര നിർമ്മിക്കുന്നത് ഈ രീതിയിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു.ഈ സാമ്പിളുകൾ സാധാരണയായി സാന്ദ്രീകൃത സ്റ്റോക്ക് സൊല്യൂഷനുകളുടെ സീരിയൽ ഡൈല്യൂഷനുകൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് നിർമ്മിക്കുന്നത്, ഏറ്റവും സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്നത് 10 മടങ്ങ് നേർപ്പിക്കലാണ്.ലയിപ്പിച്ച സാമ്പിളുകളുടെ ഒരു ശ്രേണി ഉപയോഗിച്ച്, Cq മൂല്യം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് സ്റ്റാൻഡേർഡ് qPCR പ്രോഗ്രാം ഉപയോഗിച്ച്, അവസാനം ഓരോ സാമ്പിളിന്റെയും സാന്ദ്രതയും Cq= -klgX0+b എന്ന ലീനിയർ സമവാക്യവും, E=10(-1 /k)-1 ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയും ലഭിക്കുന്നതിന് അനുബന്ധ Cq മൂല്യവും അനുസരിച്ച് ഒരു സാധാരണ വക്രം വരയ്ക്കുക.ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് വിശകലനത്തിനായി qPCR ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത 90%-110% (3.6>k>3.1) പരിധിയിലായിരിക്കണം.
കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയുള്ള സാമ്പിളുകൾ കണ്ടെത്തൽ
സാമ്പിൾ കോൺസൺട്രേഷൻ കുറവായിരിക്കുമ്പോൾ, വ്യത്യസ്ത പ്രൈമർ പ്രോബുകളുടെ കണ്ടെത്തൽ നിരക്ക് വ്യത്യസ്തമായിരിക്കും.പകർപ്പെടുക്കാൻ ഞങ്ങൾ 20 സാന്ദ്രത കുറഞ്ഞ സാമ്പിളുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നു, ഏറ്റവും ഉയർന്ന ഡിറ്റക്ഷൻ റേറ്റ് ഉള്ള പ്രൈമർ-പ്രോബ് സിസ്റ്റമാണ് ഏറ്റവും മികച്ചത്.
കോഫിഫിഷ്യന്റ് ഓഫ് വേരിയേഷൻ (സിവി)
ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഡിറ്റക്ഷനിനായുള്ള റീജന്റെ ലൈൻ സ്റ്റാൻഡേർഡ് അനുസരിച്ച് വ്യത്യസ്ത പ്രൈമർ പ്രോബുകൾ ഉപയോഗിച്ച് 10 ഡ്യൂപ്ലിക്കേറ്റ് സാമ്പിളുകൾ കണ്ടെത്താനാകും.
ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് റിയാഗന്റുകൾ:
കൃത്യത
ഒരു ബാച്ചിനുള്ളിലെ കൃത്യത പാലിക്കണം: ടെസ്റ്റ് കോൺസൺട്രേഷന്റെ ലോഗരിഥമിക് മൂല്യത്തിന്റെ വ്യതിയാനത്തിന്റെ ഗുണകം (CV,%) ≤5% ആണ്.സാമ്പിൾ കോൺസൺട്രേഷൻ കുറവായിരിക്കുമ്പോൾ, ഡിറ്റക്ഷൻ കോൺസൺട്രേഷന്റെ ലോഗരിതം കോഫിഫിഷ്യന്റ് ഓഫ് വേരിയേഷൻ (CV,%) ≤10% ആണ്
ഗുണപരമായ പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങൾ:
കൃത്യത
ഒരു ബാച്ചിലെ കൃത്യത പാലിക്കണം:
(1) Ct മൂല്യത്തിന്റെ വ്യതിയാനത്തിന്റെ ഗുണകം (CV,%) ≤5%
ഒരേ സാമ്പിൾ 10 തവണ സമാന്തരമായി പരിശോധിക്കുന്നു, പരിശോധനാ ഫലങ്ങൾ സ്ഥിരതയുള്ളതായിരിക്കണം
പോസ്റ്റ് സമയം: സെപ്റ്റംബർ-18-2021