ആരംഭ മെറ്റീരിയൽ: RNA
ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പിസിആർ (ആർടി-ക്യുപിസിആർ) എന്നത് പിസിആർ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ ആർഎൻഎയെ പ്രാരംഭ മെറ്റീരിയലായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു പരീക്ഷണാത്മക രീതിയാണ്.ഈ രീതിയിൽ, മൊത്തം ആർഎൻഎ അല്ലെങ്കിൽ മെസഞ്ചർ ആർഎൻഎ (എംആർഎൻഎ) ആദ്യം റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് വഴി കോംപ്ലിമെന്ററി ഡിഎൻഎ (സിഡിഎൻഎ) ആയി ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്യപ്പെടുന്നു.തുടർന്ന്, cDNA ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിച്ച് ഒരു qPCR പ്രതികരണം നടത്തി.ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വിശകലനം, ആർഎൻഎ ഇടപെടൽ മൂല്യനിർണ്ണയം, മൈക്രോഅറേ മൂല്യനിർണ്ണയം, രോഗകാരി കണ്ടെത്തൽ, ജനിതക പരിശോധന, രോഗ ഗവേഷണം എന്നിവ ഉൾപ്പെടെ വിവിധ മോളിക്യുലാർ ബയോളജി ആപ്ലിക്കേഷനുകളിൽ RT-qPCR ഉപയോഗിക്കുന്നു.
RT-qPCR-നുള്ള ഒരു-ഘട്ട, രണ്ട്-ഘട്ട രീതികൾ
RT-qPCR ഒരു-ഘട്ടമോ രണ്ട്-ഘട്ടമോ ഉപയോഗിച്ച് പൂർത്തിയാക്കാൻ കഴിയും.ഒരു-ഘട്ട RT-qPCR റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും സംയോജിപ്പിക്കുന്നു, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസും ഡിഎൻഎ പോളിമറേസും ഒരേ ബഫർ അവസ്ഥയിൽ ഒരേ ട്യൂബിൽ പ്രതികരണം പൂർത്തിയാക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു.ഒരു-ഘട്ട RT-qPCR-ന് സീക്വൻസ്-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ മാത്രമേ ആവശ്യമുള്ളൂ.രണ്ട്-ഘട്ട RT-qPCR-ൽ, വ്യത്യസ്ത ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത ബഫറുകൾ, റിയാക്ഷൻ അവസ്ഥകൾ, പ്രൈമർ ഡിസൈൻ സ്ട്രാറ്റജികൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് രണ്ട് ട്യൂബുകളിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും നടത്തുന്നു.
| പ്രയോജനം | ദോഷം | |
| ഒരു ചുവട് | രണ്ട് പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളും ഒരു ട്യൂബിൽ ചെയ്യുന്നതിനാൽ ഈ രീതിക്ക് പരീക്ഷണാത്മക പിശക് കുറവാണ്
കുറച്ച് പൈപ്പിംഗ് ഘട്ടങ്ങൾ മലിനീകരണ സാധ്യത കുറയ്ക്കുന്നു
ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ/സ്‌ക്രീനിംഗിന് അനുയോജ്യം, വേഗതയേറിയതും പുനർനിർമ്മിക്കാവുന്നതുമാണ് | രണ്ട്-ഘട്ട പ്രതികരണങ്ങൾ പ്രത്യേകം ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യാൻ കഴിയില്ല
രണ്ട്-ഘട്ട പ്രതികരണം സംയോജിപ്പിച്ച് പ്രതികരണ സാഹചര്യങ്ങൾ വിട്ടുവീഴ്ച ചെയ്യപ്പെടുന്നതിനാൽ, സംവേദനക്ഷമത രണ്ട്-ഘട്ട രീതിയുടേത് പോലെ മികച്ചതല്ല.
ഒരൊറ്റ സാമ്പിൾ കണ്ടെത്തിയ ലക്ഷ്യങ്ങളുടെ എണ്ണം ചെറുതാണ് |
| രണ്ട് ഘട്ടങ്ങൾ | സുസ്ഥിരമായ cDNA ലൈബ്രറികൾ സൃഷ്ടിക്കാനുള്ള കഴിവ്, അത് ദീർഘകാലത്തേക്ക് സൂക്ഷിക്കാനും ഒന്നിലധികം പ്രതികരണങ്ങളിൽ ഉപയോഗിക്കാനും കഴിയും
ഒന്നിലധികം cDNA ലൈബ്രറികളുടെ ആവശ്യമില്ലാതെ ഒരേ cDNA ലൈബ്രറിയിൽ നിന്ന് ടാർഗെറ്റ് ജീനുകളും റഫറൻസ് ജീനുകളും വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.
സിംഗിൾ റിയാക്ഷൻ റണ്ണുകളുടെ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ പ്രവർത്തനക്ഷമമാക്കുന്ന പ്രതികരണ ബഫറുകളും പ്രതികരണ വ്യവസ്ഥകളും
ട്രിഗർ വ്യവസ്ഥകളുടെ വഴക്കമുള്ള തിരഞ്ഞെടുപ്പ് | ഒന്നിലധികം ട്യൂബുകളും കൂടുതൽ പൈപ്പിംഗ് ഘട്ടങ്ങളും ഉപയോഗിക്കുന്നത് ഡിഎൻഎ മലിനീകരണത്തിന്റെ സാധ്യത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു, സമയനഷ്ടവും.
ഒറ്റ-ഘട്ട രീതിയേക്കാൾ കൂടുതൽ ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ ആവശ്യമാണ് |
ബന്ധപ്പെട്ട ഉല്പന്നങ്ങൾ:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (ഒരു ഘട്ടം)-SYBR ഗ്രീൻ I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (ഒരു ഘട്ടം)-തക്മാൻ
ആദ്യ സ്‌ട്രാൻഡ് സിഡിഎൻഎ സിന്തസിസിനായുള്ള ആർടി ഈസി ഐ മാസ്റ്റർ പ്രീമിക്‌സ്
റിയൽ ടൈം PCR Easyᴹ-SYBR ഗ്രീൻ ഐ കിറ്റ്
മൊത്തം RNA, mRNA എന്നിവയുടെ തിരഞ്ഞെടുപ്പ്
ഒരു RT-qPCR പരീക്ഷണം രൂപകൽപന ചെയ്യുമ്പോൾ, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനുള്ള ടെംപ്ലേറ്റായി മൊത്തം RNA അല്ലെങ്കിൽ ശുദ്ധീകരിച്ച mRNA ഉപയോഗിക്കണമോ എന്ന് തീരുമാനിക്കേണ്ടത് പ്രധാനമാണ്.mRNA യ്ക്ക് അൽപ്പം ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമത നൽകാൻ കഴിയുമെങ്കിലും, മൊത്തം RNA ഇപ്പോഴും പതിവായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഇതിനുള്ള കാരണം, mRNA യെക്കാൾ ഒരു ആരംഭ മെറ്റീരിയൽ എന്ന നിലയിൽ മൊത്തം RNA യ്ക്ക് കൂടുതൽ പ്രധാന നേട്ടമുണ്ട്.ആദ്യം, പ്രക്രിയയ്ക്ക് കുറച്ച് ശുദ്ധീകരണ ഘട്ടങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്, ഇത് ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ മികച്ച അളവ് വീണ്ടെടുക്കലും സെൽ നമ്പറുകൾ ആരംഭിക്കുന്നതിന് ഫലങ്ങളുടെ മികച്ച നോർമലൈസേഷനും ഉറപ്പാക്കുന്നു.രണ്ടാമതായി, ഇത് mRNA സമ്പുഷ്ടീകരണ ഘട്ടം ഒഴിവാക്കുന്നു, ഇത് വ്യത്യസ്ത mRNA-കളുടെ വ്യത്യസ്ത വീണ്ടെടുക്കൽ കാരണം വളച്ചൊടിച്ച ഫലങ്ങളുടെ സാധ്യത ഒഴിവാക്കാം.മൊത്തത്തിൽ, മിക്ക ആപ്ലിക്കേഷനുകളിലും ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ ആപേക്ഷിക അളവ് കണ്ടെത്തലിന്റെ കേവല സംവേദനക്ഷമതയേക്കാൾ പ്രധാനമാണ്, മിക്ക കേസുകളിലും മൊത്തം ആർഎൻഎ കൂടുതൽ അനുയോജ്യമാണ്.
റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രൈമർ
രണ്ട്-ഘട്ട രീതിയിൽ, cDNA പ്രതികരണത്തെ പ്രൈം ചെയ്യാൻ മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത രീതികൾ ഉപയോഗിക്കാം: ഒലിഗോ(dT) പ്രൈമറുകൾ, റാൻഡം പ്രൈമറുകൾ അല്ലെങ്കിൽ സീക്വൻസ്-സ്പെസിഫിക് പ്രൈമറുകൾ.സാധാരണഗതിയിൽ, ഒലിഗോ(ഡിടി) പ്രൈമറുകളും റാൻഡം പ്രൈമറുകളും സംയോജിതമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഈ പ്രൈമറുകൾ ടെംപ്ലേറ്റ് എംആർഎൻഎ സ്ട്രാൻഡുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും സമന്വയത്തിനുള്ള ഒരു ആരംഭ പോയിന്റുമായി റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു.
| പ്രൈമർ തിരഞ്ഞെടുക്കൽ | ഘടനയും പ്രവർത്തനവും | പ്രയോജനം | ദോഷം |
| ഒലിഗോ(ഡിടി) പ്രൈമർ (അല്ലെങ്കിൽ ആങ്കർ ചെയ്ത ഒലിഗോ(ഡിടി) പ്രൈമർ) | എംആർഎൻഎയുടെ പോളി(എ) വാലിൽ തൈമിൻ അവശിഷ്ടങ്ങളിലേക്കുള്ള വിപുലീകൃത അനീലിംഗ്;ആങ്കർ ഒലിഗോ(dT) പ്രൈമറിൽ 3′ അറ്റത്ത് (ആങ്കർ സൈറ്റ്) G, C അല്ലെങ്കിൽ A അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു | പോളി(എ)-ടെയിൽഡ് എംആർഎൻഎയിൽ നിന്നുള്ള മുഴുനീള സിഡിഎൻഎയുടെ സമന്വയം
കുറഞ്ഞ ആരംഭ മെറ്റീരിയൽ ലഭ്യമാകുമ്പോൾ ബാധകമാണ്
എംആർഎൻഎയുടെ 5′ പോളി(എ) വാലുമായി ഒലിഗോ(ഡിടി) പ്രൈമർ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതായി ആങ്കറിംഗ് സൈറ്റ് ഉറപ്പാക്കുന്നു. | പോളി(എ) വാലുകളുള്ള ജീനുകൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് മാത്രം അനുയോജ്യം
പോളി(എ)യിലെ പ്രൈമിംഗ് സൈറ്റ്*2 ൽ നിന്ന് വെട്ടിച്ചുരുക്കിയ cDNA നേടുക
3′ അവസാനം വരെ ബന്ധിപ്പിക്കാൻ പക്ഷപാതം*
*നങ്കൂരമിട്ട ഒലിഗോ(dT) പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ചാൽ ഈ സാധ്യത കുറയും |
| റാൻഡം പ്രൈമർ
| 6 മുതൽ 9 വരെ ബേസുകൾ നീളം, ആർഎൻഎ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സമയത്ത് ഒന്നിലധികം സൈറ്റുകളിലേക്ക് അനൽ ചെയ്യാൻ കഴിയും | എല്ലാ ആർഎൻഎകളിലേക്കും അനിയൽ (tRNA, rRNA, mRNA)
കാര്യമായ ദ്വിതീയ ഘടനയുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾക്ക് അനുയോജ്യം, അല്ലെങ്കിൽ കുറഞ്ഞ പ്രാരംഭ മെറ്റീരിയൽ ലഭ്യമാകുമ്പോൾ
ഉയർന്ന cDNA വിളവ് | സിഡിഎൻഎ എല്ലാ ആർഎൻഎയിൽ നിന്നും റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രൈബ് ചെയ്യപ്പെടുന്നു, ഇത് സാധാരണയായി ആവശ്യമില്ലാത്തതും ടാർഗെറ്റ് എംആർഎൻഎയുടെ സിഗ്നലിനെ നേർപ്പിച്ചേക്കാം.
വെട്ടിച്ചുരുക്കിയ cDNA നേടുക |
| സീക്വൻസ്-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ | നിർദ്ദിഷ്ട mRNA സീക്വൻസുകൾ ടാർഗെറ്റുചെയ്യുന്ന ഇഷ്‌ടാനുസൃത പ്രൈമറുകൾ | നിർദ്ദിഷ്ട cDNA ലൈബ്രറി
സംവേദനക്ഷമത മെച്ചപ്പെടുത്തുക
റിവേഴ്സ് qPCR പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു | ഒരൊറ്റ ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ സമന്വയത്തിൽ മാത്രം പരിമിതപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു |
റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്
ഡിഎൻഎയെ സമന്വയിപ്പിക്കാൻ ആർഎൻഎ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു എൻസൈമാണ് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്.ചില റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസുകൾക്ക് RNase ആക്റ്റിവിറ്റി ഉണ്ട്, ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന് ശേഷം RNA-DNA ഹൈബ്രിഡ് സ്ട്രോണ്ടുകളിൽ RNA സ്ട്രാൻഡുകളെ തരംതാഴ്ത്താൻ കഴിയും.ഇതിന് RNase എൻസൈമാറ്റിക് പ്രവർത്തനം ഇല്ലെങ്കിൽ, ഉയർന്ന qPCR കാര്യക്ഷമതയ്ക്കായി RNaseH ചേർക്കാവുന്നതാണ്.സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന എൻസൈമുകളിൽ മൊളോണി മ്യൂറിൻ ലുക്കീമിയ വൈറസ് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്, ഏവിയൻ മൈലോബ്ലാസ്റ്റോമ വൈറസ് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു.RT-qPCR-ന്, ഉയർന്ന തെർമോസ്റ്റബിലിറ്റിയുള്ള ഒരു റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നത് അനുയോജ്യമാണ്, അതുവഴി ഉയർന്ന താപനിലയിൽ cDNA സിന്തസിസ് നടത്താം, ഉയർന്ന ദ്വിതീയ ഘടനയുള്ള ആർഎൻഎകളുടെ വിജയകരമായ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഉറപ്പാക്കുന്നു, പ്രതികരണത്തിലുടനീളം അവയുടെ മുഴുവൻ പ്രവർത്തനവും നിലനിർത്തുന്നു, ഉയർന്ന cDNA വിളവ് ലഭിക്കും.
ബന്ധപ്പെട്ട ഉല്പന്നങ്ങൾ:
ഫോർയേസി എം-എംഎൽവി റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്
റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസിന്റെ RNase H പ്രവർത്തനം
ആർഎൻഎ-ഡിഎൻഎ ഡ്യൂപ്ലെക്സുകളിൽ നിന്ന് ആർഎൻഎ സ്ട്രാൻഡുകളെ തരംതാഴ്ത്താൻ ആർഎൻഎസിഎച്ചിന് കഴിയും, ഇത് ഇരട്ട-സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎയുടെ കാര്യക്ഷമമായ സമന്വയം അനുവദിക്കുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, ദൈർഘ്യമേറിയ mRNA ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, RNA അകാലത്തിൽ നശിപ്പിച്ചേക്കാം, അതിന്റെ ഫലമായി cDNA വെട്ടിച്ചുരുക്കുന്നു.അതിനാൽ, ദൈർഘ്യമേറിയ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെ സമന്വയം വേണമെങ്കിൽ cDNA ക്ലോണിംഗ് സമയത്ത് RNaseH പ്രവർത്തനം കുറയ്ക്കുന്നത് പലപ്പോഴും പ്രയോജനകരമാണ്.ഇതിനു വിപരീതമായി, RNase H പ്രവർത്തനമുള്ള റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റസുകൾ qPCR ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്ക് പലപ്പോഴും പ്രയോജനകരമാണ്, കാരണം PCR-ന്റെ ആദ്യ സൈക്കിളിൽ RNA-DNA ഡ്യൂപ്ലെക്സുകൾ ഉരുകുന്നത് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു.
പ്രൈമർ ഡിസൈൻ
RT-qPCR-ലെ qPCR ഘട്ടത്തിനായി ഉപയോഗിക്കുന്ന PCR പ്രൈമറുകൾ ഒരു എക്സോൺ-എക്സോൺ ജംഗ്‌ഷനെ വ്യാപിപ്പിക്കുന്നതിന് അനുയോജ്യമായ രീതിയിൽ രൂപകൽപ്പന ചെയ്‌തിരിക്കണം, അവിടെ ഒരു ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പ്രൈമറിന് യഥാർത്ഥ എക്സോൺ-ഇൻട്രോൺ അതിർത്തി വ്യാപിക്കാൻ കഴിയും.ഇൻട്രോൺ അടങ്ങിയ ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ സീക്വൻസുകൾ വർദ്ധിപ്പിക്കാത്തതിനാൽ, ഈ ഡിസൈൻ ജനിതക ഡിഎൻഎയെ മലിനമാക്കുന്നതിൽ നിന്ന് തെറ്റായ പോസിറ്റീവുകളുടെ സാധ്യത കുറയ്ക്കുന്നു.
എക്സോണുകളെയോ എക്സോൺ-എക്സോൺ അതിരുകളെയോ വേർതിരിക്കാൻ പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യാൻ കഴിയുന്നില്ലെങ്കിൽ, ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ മലിനീകരണം നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി ആർഎൻഎ സാമ്പിളുകൾ ആർഎൻഎ-ഫ്രീ ഡിനേസ് ഐ അല്ലെങ്കിൽ ഡിഎസ്ഡിനേസ് ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കേണ്ടത് ആവശ്യമായി വന്നേക്കാം.
RT-qPCR നിയന്ത്രണം
എല്ലാ RT-qPCR പരീക്ഷണങ്ങളിലും ഡിഎൻഎ മലിനീകരണം (ജീനോമിക് ഡിഎൻഎ അല്ലെങ്കിൽ മുൻ പ്രതികരണങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള പിസിആർ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ പോലുള്ളവ) കണ്ടെത്തുന്നതിന് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ നെഗറ്റീവ് കൺട്രോൾ (-ആർടി കൺട്രോൾ) ഉൾപ്പെടുത്തണം.ഈ നിയന്ത്രണത്തിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് ഒഴികെയുള്ള എല്ലാ പ്രതികരണ ഘടകങ്ങളും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.ഈ നിയന്ത്രണത്തിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ സംഭവിക്കാത്തതിനാൽ, പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ നിരീക്ഷിക്കുകയാണെങ്കിൽ, ഡിഎൻഎയിൽ നിന്നുള്ള മലിനീകരണം ഏറ്റവും കൂടുതലാണ്.
പോസ്റ്റ് സമയം: ഓഗസ്റ്റ്-02-2022
