സിവിയർ അക്യൂട്ട് റെസ്പിറേറ്ററി സിൻഡ്രോം കൊറോണ വൈറസ് ടൈപ്പ് 2 മൂലമുണ്ടാകുന്ന ഒരു പകർച്ചവ്യാധിയാണ് COVID-19. ഒരു വ്യക്തി രോഗബാധിതനാകുമ്പോൾ, പനി, ചുമ, ശ്വാസതടസ്സം എന്നിവയാണ് ഏറ്റവും സാധാരണമായ ലക്ഷണങ്ങൾ.

പരിശോധനയ്‌ക്കായി ഉപയോഗിക്കുന്ന സാമ്പിളുകൾ നാസോഫറിംഗിയൽ സ്‌വാബ്‌സ് അല്ലെങ്കിൽ ഓറോഫാറിഞ്ചിയൽ സ്വാബ്‌സ് ഉപയോഗിച്ച് ശേഖരിക്കാം.

എന്താണ് PCR?

പോളിമറേസ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ, പിസിആർ ആണ് കൊറോണ വൈറസ് കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള അടിസ്ഥാന രീതി.മോളിക്യുലാർ ബയോളജിയിൽ വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു രീതിയാണിത്.ദശലക്ഷക്കണക്കിന് മുതൽ കോടിക്കണക്കിന് പ്രത്യേക ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങൾ വേഗത്തിൽ പകർത്താൻ ഇതിന് കഴിയും.

പുതിയ കൊറോണ വൈറസിൽ വളരെ ദൈർഘ്യമേറിയ ഒറ്റ-ധാരയുള്ള RNA ജീനോം അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.പിസിആർ വഴി ഈ വൈറസുകളെ കണ്ടെത്തുന്നതിന്, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് വഴി ആർഎൻഎ തന്മാത്രകളെ അവയുടെ പൂരക ഡിഎൻഎ സീക്വൻസുകളായി പരിവർത്തനം ചെയ്യണം, തുടർന്ന് പുതുതായി സമന്വയിപ്പിച്ച ഡിഎൻഎ സാധാരണ പിസിആർ നടപടിക്രമങ്ങൾ വഴി വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും, ഇത് സാധാരണയായി ആർടി-പിസിആർ എന്നറിയപ്പെടുന്നു.

RT-PCR പ്രക്രിയ

ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ

ഈ രീതി നടപ്പിലാക്കാൻ, വൈറൽ ആർഎൻഎ അടിസ്ഥാനപരമായി വേർതിരിച്ചെടുക്കണം.സൗകര്യപ്രദവും വേഗതയേറിയതും ഫലപ്രദവുമായ വേർതിരിവിന് വൈവിധ്യമാർന്ന RNA ശുദ്ധീകരണ കിറ്റുകൾ ഉപയോഗിക്കാം.

ഒരു കൊമേഴ്‌സ്യൽ കിറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് വൈറൽ ആർഎൻഎ എക്‌സ്‌ട്രാക്‌റ്റുചെയ്യുന്നതിന്, ആദ്യം സാമ്പിൾ ഒരു മൈക്രോസെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിലേക്ക് ചേർക്കുക, തുടർന്ന് ലൈസിസ് ബഫറുമായി മിക്സ് ചെയ്യുക.ഈ ബഫർ വളരെ ഡിനേച്ചർഡ് ആണ്, സാധാരണയായി ഫിനോൾ, ഗ്വാനിഡിൻ ഐസോത്തിയോസയനേറ്റ് എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.കൂടാതെ, കേടുകൂടാത്ത വൈറൽ ആർ‌എൻ‌എയുടെ ഒറ്റപ്പെടൽ ഉറപ്പാക്കാൻ ആർ‌നേസ് ഇൻ‌ഹിബിറ്ററുകൾ സാധാരണയായി ലിസിസ് ബഫറിൽ ഉണ്ട്.

ലിസിസ് ബഫർ ചേർത്ത ശേഷം, മിക്സിംഗ് ട്യൂബ് പൾസ് ഉപയോഗിച്ച് വോർട്ടക്സ് ചെയ്ത് ഊഷ്മാവിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.പിന്നീട് ലൈസിസ് ബഫർ നൽകുന്ന ഉയർന്ന ഡിനാറ്ററിംഗ് സാഹചര്യങ്ങളിൽ വൈറസ് ലൈസ് ചെയ്യപ്പെടുന്നു.

സാമ്പിൾ ലൈസ് ചെയ്ത ശേഷം, ശുദ്ധീകരണ പ്രക്രിയയ്ക്കായി ഒരു സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബ് ഉപയോഗിക്കുന്നു.സാമ്പിൾ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിലേക്ക് ലോഡുചെയ്യുകയും തുടർന്ന് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു.

ഈ നടപടിക്രമം ഒരു സോളിഡ് ഫേസ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ രീതിയാണ്, അതിൽ നിശ്ചല ഘട്ടത്തിൽ ഒരു സിലിക്ക ജെൽ മാട്രിക്സ് അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.

ഒപ്റ്റിമൽ ഉപ്പ്, പിഎച്ച് അവസ്ഥകളിൽ, ആർഎൻഎ തന്മാത്രകൾ സിലിക്ക മെംബ്രണുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു.

അതേ സമയം, പ്രോട്ടീനും മറ്റ് മാലിന്യങ്ങളും നീക്കം ചെയ്യപ്പെടുന്നു.

സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷന് ശേഷം, സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബ് വൃത്തിയുള്ള ഒരു ശേഖരണ ട്യൂബിലേക്ക് ഇടുക, ഫിൽട്രേറ്റ് ഉപേക്ഷിക്കുക, തുടർന്ന് വാഷിംഗ് ബഫർ ചേർക്കുക.

മെംബ്രണിലൂടെ വാഷ് ബഫർ നിർബന്ധിതമാക്കാൻ ട്യൂബ് വീണ്ടും സെൻട്രിഫ്യൂജിൽ വയ്ക്കുക.ഇത് മെംബ്രണിൽ നിന്ന് ശേഷിക്കുന്ന എല്ലാ മാലിന്യങ്ങളും നീക്കം ചെയ്യും, സിലിക്ക ജെല്ലുമായി ബന്ധിപ്പിച്ച ആർഎൻഎ മാത്രം അവശേഷിക്കുന്നു.

സാമ്പിൾ കഴുകിയ ശേഷം, ട്യൂബ് വൃത്തിയുള്ള മൈക്രോസെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിലേക്ക് ഇട്ടു, എല്യൂഷൻ ബഫർ ചേർക്കുക.

മെംബ്രണിലൂടെ എല്യൂഷൻ ബഫറിനെ നിർബന്ധിതമാക്കാൻ ഇത് സെന്റീഫ്യൂജ് ചെയ്യുന്നു.എല്യൂഷൻ ബഫർ സ്പിൻ കോളത്തിൽ നിന്ന് വൈറൽ ആർഎൻഎയെ നീക്കം ചെയ്യുകയും പ്രോട്ടീനുകൾ, ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ, മറ്റ് മാലിന്യങ്ങൾ എന്നിവയില്ലാതെ ശുദ്ധീകരിച്ച ആർഎൻഎ നേടുകയും ചെയ്യുന്നു.

ഘട്ടം 2

മിക്സഡ് ഏകാഗ്രത

വൈറൽ ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുത്ത ശേഷം, പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി പ്രതികരണ മിശ്രിതം തയ്യാറാക്കുകയാണ് അടുത്ത ഘട്ടം.ഈ ഘട്ടത്തിൽ, ഏകാഗ്രത ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഈ സാന്ദ്രീകൃത പരിഹാരം ഒരു പ്രീമിക്സ്, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്, ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ, ഫോർവേഡ് പ്രൈമർ, റിവേഴ്സ് പ്രൈമർ, ടാക്മാൻ പ്രോബ്, ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് എന്നിവ അടങ്ങിയ ഒരു പ്രീമിക്സ്ഡ് കോൺസൺട്രേറ്റഡ് സൊല്യൂഷനാണ്.

അവസാനമായി, ഈ പ്രതികരണ മിശ്രിതം പൂർത്തിയാക്കാൻ, RNA ടെംപ്ലേറ്റ് ചേർക്കുന്നു.ട്യൂബുകൾ പൾസ് വോർട്ടക്സിംഗ് വഴി മിക്സഡ് ചെയ്യുന്നു, തുടർന്ന് പ്രതികരണ മിശ്രിതം പിസിആർ പ്ലേറ്റിലേക്ക് ലോഡ് ചെയ്യുന്നു.PCR പ്ലേറ്റിൽ സാധാരണയായി 96 കിണറുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, ഒരേ സമയം ഒന്നിലധികം സാമ്പിളുകൾ വിശകലനം ചെയ്യാൻ കഴിയും.

ഘട്ടം 3

പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ

അടുത്തതായി, പിസിആർ മെഷീനിൽ പ്ലേറ്റ് സ്ഥാപിക്കുക, അത് പ്രധാനമായും ഒരു തെർമൽ സൈക്ലറാണ്.

RdrRP ജീൻ, E ജീൻ, N ജീൻ എന്നിവയിലെ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് വർദ്ധിപ്പിച്ച് 2019 നോവൽ കൊറോണ വൈറസ് കണ്ടെത്തുന്നതിന് തത്സമയ RT-PCR ഉപയോഗിക്കുന്നു.ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് പ്രൈമർ, പ്രോബ് സീക്വൻസ് എന്നിവയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.

RT-PCR ന്റെ ആദ്യ ഘട്ടം റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ആണ്.വൈറൽ ആർഎൻഎ ജീനോമിന്റെ പൂരക ഭാഗവുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന പിസിആർ റിവേഴ്സ് പ്രൈമർ മുഖേനയാണ് കോംപ്ലിമെന്ററി ഡിഎൻഎയുടെ ആദ്യ സ്ട്രാൻഡ് സിന്തസൈസ് ചെയ്യുന്നത്.തുടർന്ന് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ്, വൈറൽ ആർഎൻഎയ്ക്ക് പൂരകമായ ഡിഎൻഎയെ സമന്വയിപ്പിക്കുന്നതിന് പ്രൈമറിന്റെ 3′അറ്റത്ത് ഡിഎൻഎ ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകൾ ചേർക്കുന്നു.ഈ ഘട്ടത്തിന്റെ താപനിലയും ദൈർഘ്യവും പ്രൈമറുകൾ, ടാർഗെറ്റ് ആർഎൻഎ, ഉപയോഗിച്ച റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റസ് എന്നിവയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.

അടുത്തതായി, ഒരു പ്രാരംഭ ഡീനാറ്ററേഷൻ ഘട്ടം പ്രയോഗിക്കുന്നു, ഇത് RNA-DNA ഹൈബ്രിഡിന്റെ ഡീനാറ്ററേഷനിൽ കലാശിക്കുന്നു.ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് സജീവമാക്കുന്നതിന് ഈ ഘട്ടം ആവശ്യമാണ്.അതേ സമയം, റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേസ് പ്രവർത്തനരഹിതമാണ്.

പിസിആർ താപ ചക്രങ്ങളുടെ ഒരു ശ്രേണി ഉൾക്കൊള്ളുന്നു.ഓരോ സൈക്കിളിലും ഡീനാറ്ററേഷൻ, അനീലിംഗ്, എക്സ്റ്റൻഷൻ സ്റ്റെപ്പുകൾ എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.

പ്രതികരണ അറയെ 95 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലേക്ക് ചൂടാക്കി ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ ഡീനാറ്ററേഷനായി ഉപയോഗിക്കുന്നതാണ് ഡിനാറ്ററേഷൻ ഘട്ടം.

അടുത്ത ഘട്ടത്തിൽ, പ്രതികരണ താപനില 58 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസായി കുറയുന്നു, ഇത് ഫോർവേഡ് പ്രൈമറിനെ അതിന്റെ സിംഗിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ പൂരക ഭാഗത്തേക്ക് മാറ്റാൻ അനുവദിക്കുന്നു.അനീലിംഗ് താപനില നേരിട്ട് പ്രൈമറിന്റെ നീളത്തെയും ഘടനയെയും ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.

വിപുലീകരണ ഘട്ടത്തിൽ, ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റ് സ്‌ട്രാൻഡിന് പൂരകമായ ഒരു പുതിയ ഡിഎൻഎ സ്‌ട്രാൻഡ് സമന്വയിപ്പിക്കുന്നു.പ്രതികരണ മിശ്രിതത്തിൽ നിന്ന് 5′ to 3′ദിശയിലുള്ള ടെംപ്ലേറ്റിലേക്ക് പൂരകമായ സ്വതന്ത്ര ന്യൂക്ലിയസ് ചേർക്കുന്നതിലൂടെ.ഈ ഘട്ടത്തിന്റെ താപനില ഉപയോഗിക്കുന്ന ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിനെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.

ആദ്യ സൈക്കിളിനുശേഷം, ഇരട്ട-ധാരയുള്ള ഡിഎൻഎ ലക്ഷ്യം ലഭിക്കും.

തുടർന്ന്, രണ്ടാമത്തെ ചക്രം നൽകുക.രണ്ട് ഒറ്റ-ധാരയുള്ള ഡിഎൻഎ തന്മാത്രകൾ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിന് ഇരട്ട-ധാരയുള്ള ഡിഎൻഎ ഡീനാച്ചർ ചെയ്യുന്നു.

അടുത്ത ഘട്ടത്തിൽ, പ്രതികരണ ഊഷ്മാവ് കുറയ്ക്കുന്നു, പ്രൈമറുകൾ ഓരോ സിംഗിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ ടെംപ്ലേറ്റിലേക്കും അനീൽ ചെയ്യുന്നു, ടാക്-മാൻ പ്രോബ് ടാർഗെറ്റ് ഡിഎൻഎയുടെ പൂരക ഭാഗത്തേക്ക് അനെൽ ചെയ്യുന്നു.

ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് പേടകത്തിന്റെ 5′അറ്റവുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിട്ടുള്ള ഫ്ലൂറോഫോർ അടങ്ങിയതാണ് ടാക്മാൻ അന്വേഷണം.സൈക്ലറിന്റെ പ്രകാശ സ്രോതസ്സിനാൽ ആവേശഭരിതമാകുമ്പോൾ, ഫ്ലൂറോഫോർ ഫ്ലൂറസെൻസ് പുറപ്പെടുവിക്കുന്നു.കൂടാതെ, പേടകം 3′അറ്റത്തുള്ള ഒരു ക്വഞ്ചർ ഉപയോഗിച്ചാണ് നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നത്.റിപ്പോർട്ടർ ജീനിന്റെ സാമീപ്യം ക്വഞ്ചറുമായി ഫ്ലൂറസെൻസ് കണ്ടെത്തുന്നത് തടയുന്നു.

വിപുലീകരണ ഘട്ടത്തിൽ, ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ് ഒരു പുതിയ സ്ട്രാൻഡ് സമന്വയിപ്പിക്കുന്നു.പോളിമറേസ് ടാക്മാൻ പ്രോബിൽ എത്തുമ്പോൾ, അതിന്റെ എൻഡോജെനസ് 5′ന്യൂക്ലീസ് പ്രവർത്തനം പേടകത്തെ പിളർത്തുന്നു, ഇത് ചായത്തെ കെടുത്തുന്നതിൽ നിന്ന് വേർതിരിക്കുന്നു.

പിസിആറിന്റെ ഓരോ സൈക്കിളിലും, കൂടുതൽ ഡൈ തന്മാത്രകൾ പുറത്തുവരുന്നു, അതിന്റെ ഫലമായി സമന്വയിപ്പിച്ച ആംപ്ലിക്കോണുകളുടെ എണ്ണത്തിന് ആനുപാതികമായ ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത വർദ്ധിക്കുന്നു.

സാമ്പിളിൽ നൽകിയിരിക്കുന്ന ഒരു ശ്രേണിയുടെ എണ്ണം കണക്കാക്കാൻ ഈ രീതി അനുവദിക്കുന്നു.ഓരോ സൈക്കിളിലും ഇരട്ട സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ എണ്ണം ഇരട്ടിയാകുന്നു.അതിനാൽ, വളരെ ചെറിയ സാമ്പിളുകൾ വിശകലനം ചെയ്യാൻ PCR ഉപയോഗിക്കാം.

ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നൽ അളക്കുന്നതിന്, ടങ്സ്റ്റൺ ഹാലൊജൻ ലാമ്പ്, എക്സിറ്റേഷൻ ഫിൽറ്റർ, റിഫ്ലക്ടർ, ലെൻസ്, എമിഷൻ ഫിൽട്ടർ, ചാർജ് കപ്പിൾഡ് ഡിവൈസ്-ഉപയോഗിക്കുന്ന സിസിഡി ക്യാമറ.

സ്റ്റെപ്പ് 4 കണ്ടുപിടിക്കുക

ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നൽ അളക്കുന്നതിന്, ടങ്സ്റ്റൺ ഹാലൊജൻ ലാമ്പ്, എക്സിറ്റേഷൻ ഫിൽറ്റർ, റിഫ്ലക്ടർ, ലെൻസ്, എമിഷൻ ഫിൽട്ടർ, ചാർജ് കപ്പിൾഡ് ഡിവൈസ്-ഉപയോഗിക്കുന്ന സിസിഡി ക്യാമറ.

വിളക്കിൽ നിന്ന് ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത പ്രകാശം പ്രതിഫലനത്താൽ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു, കണ്ടൻസർ ലെൻസിലൂടെ കടന്നുപോകുന്നു, കൂടാതെ ഓരോ ദ്വാരത്തിന്റെയും മധ്യഭാഗത്തേക്ക് ഫോക്കസ് ചെയ്യുന്നു.തുടർന്ന് ദ്വാരത്തിൽ നിന്ന് പുറപ്പെടുവിക്കുന്ന ഫ്ലൂറസെൻസ് കണ്ണാടിയിൽ നിന്ന് പ്രതിഫലിപ്പിക്കുകയും എമിഷൻ ഫിൽട്ടറിലൂടെ കടന്നുപോകുകയും സിസിഡി ക്യാമറ കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.ഓരോ PCR സൈക്കിളിലും, സ്വയം-ആവേശമുള്ള ഫ്ലൂറോഫോർ പ്രകാശം CCD-ക്ക് കണ്ടെത്താനാകും.

ഇത് ക്യാപ്‌ചർ ചെയ്ത പ്രകാശത്തെ ഡിജിറ്റൽ ഡാറ്റയാക്കി മാറ്റുന്നു.ഈ രീതിയെ തൽസമയ PCR എന്ന് വിളിക്കുന്നു, ഇത് PCR പ്രതികരണത്തിന്റെ പുരോഗതിയുടെ തത്സമയ നിരീക്ഷണം അനുവദിക്കുന്നു.