1. ആർഎൻഎ ലായനിയുടെ ആഗിരണം കണ്ടെത്തുക

280, 320, 230, 260 nm എന്നിവയിലെ ആഗിരണം യഥാക്രമം ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ്, പശ്ചാത്തലം (പരിഹാര പ്രക്ഷുബ്ധത), ഉപ്പ് സാന്ദ്രത, പ്രോട്ടീൻ പോലുള്ള ജൈവവസ്തുക്കൾ എന്നിവയുടെ മൂല്യങ്ങളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.സാധാരണയായി OD260/OD280 (അനുപാതം, R) മാത്രം നോക്കുക.1.8~2.0 ആയിരിക്കുമ്പോൾ, ആർഎൻഎയിലെ പ്രോട്ടീനിന്റെയോ മറ്റ് ജൈവവസ്തുക്കളുടെയോ മലിനീകരണം സഹിക്കാമെന്ന് ഞങ്ങൾ കരുതുന്നു, എന്നാൽ ആഗിരണം കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള ബഫറായി ട്രൈസ് ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, R മൂല്യം 2-ൽ കൂടുതലായിരിക്കാം (സാധാരണയായി ഇത് <2.2 ആയിരിക്കണം).R<1.8 ചെയ്യുമ്പോൾ, ലായനിയിൽ പ്രോട്ടീൻ അല്ലെങ്കിൽ മറ്റ് ഓർഗാനിക് പദാർത്ഥങ്ങളുടെ മലിനീകരണം കൂടുതൽ വ്യക്തമാണ്, കൂടാതെ ആർ‌എൻ‌എയുടെ വിധി ആവശ്യങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് നിർണ്ണയിക്കാനാകും.R>2.2 ആകുമ്പോൾ, ആർഎൻഎ ഒറ്റ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡായി ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്തു എന്നാണ്.
 
2.ആർഎൻഎയുടെ ഇലക്‌ട്രോഫോറെറ്റിക് പാറ്റേൺ
സാധാരണയായി, ഡിനാറ്ററിംഗ് ജെൽ ആർഎൻഎ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസിന് ഉപയോഗിക്കുന്നു, എന്നാൽ ഇത് ആർഎൻഎയുടെ ഗുണനിലവാരം കണ്ടെത്തുന്നതിന് മാത്രമാണെങ്കിൽ, ഡിനാറ്ററിംഗ് ജെൽ ആവശ്യമില്ല, സാധാരണ അഗറോസ് ജെൽ ഉപയോഗിക്കാം.ഇലക്ട്രോഫോറെസിസിന്റെ ഉദ്ദേശ്യം 28S, 18S ബാൻഡുകളുടെ സമഗ്രതയും അവയുടെ അനുപാതവും അല്ലെങ്കിൽ എംആർഎൻഎ സ്മിയറിന്റെ സമഗ്രതയും കണ്ടെത്തുക എന്നതാണ്.സാധാരണയായി, 28S, 18S ബാൻഡുകൾ തെളിച്ചമുള്ളതും വ്യക്തവും മൂർച്ചയുള്ളതുമാണെങ്കിൽ (ബാൻഡുകളുടെ അരികുകൾ വ്യക്തമാണ്), കൂടാതെ 28S ന്റെ തെളിച്ചം 18S ബാൻഡിന്റെ ഇരട്ടിയിലധികം ആണെങ്കിൽ, ഞങ്ങൾ RNA-യുടെ ഗുണനിലവാരം നല്ലതാണെന്ന് കരുതുന്നു.
മുകളിൽ പറഞ്ഞവ നമ്മൾ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന രണ്ട് രീതികളാണ്, എന്നാൽ ഈ രണ്ട് രീതികൾക്കും ആർഎൻഎ ലായനിയിൽ ശേഷിക്കുന്ന RNase ഉണ്ടോ എന്ന് വ്യക്തമായി പറയാൻ കഴിയില്ല.ലായനിയിൽ വളരെ ചെറിയ അളവിൽ RNase ഉണ്ടെങ്കിൽ, മുകളിൽ പറഞ്ഞ രീതി ഉപയോഗിച്ച് അത് കണ്ടെത്തുന്നത് ഞങ്ങൾക്ക് ബുദ്ധിമുട്ടാണ്, എന്നാൽ തുടർന്നുള്ള മിക്ക എൻസൈമാറ്റിക് പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളും 37 ഡിഗ്രിക്ക് മുകളിലുള്ളതും വളരെക്കാലം നീണ്ടുനിൽക്കുന്നതുമാണ്.ഇങ്ങനെ, RNA ലായനിയിൽ വളരെ ചെറിയ അളവിൽ RNase ഉണ്ടെങ്കിൽ, പിന്നീടുള്ള പരീക്ഷണങ്ങളിൽ അവരുടെ പങ്ക് വഹിക്കാൻ വളരെ അനുയോജ്യമായ അന്തരീക്ഷവും സമയവും ഉണ്ടാകും, തീർച്ചയായും ഈ സമയത്ത് പരീക്ഷണം തണുത്തതായിരിക്കും.RNA ലായനിയിൽ ശേഷിക്കുന്ന RNase ഉണ്ടോ എന്ന് സ്ഥിരീകരിക്കാൻ കഴിയുന്ന ഒരു രീതി ഞങ്ങൾ ചുവടെ അവതരിപ്പിക്കുന്നു.
 
3. ചൂട് സംരക്ഷണ പരിശോധന
സാമ്പിൾ കോൺസൺട്രേഷൻ അനുസരിച്ച്, ആർഎൻഎ ലായനിയിൽ നിന്ന് രണ്ട് 1000 എൻജി ആർഎൻഎ എടുത്ത് 0.5 മില്ലി സെന്റീഫ്യൂജ് ട്യൂബിലേക്ക് ചേർക്കുക, കൂടാതെ പിഎച്ച് 7.0 ട്രൈസ് ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് 10 ul ന്റെ ആകെ വോളിയം നൽകുകയും തുടർന്ന് ട്യൂബിന്റെ തൊപ്പി അടയ്ക്കുകയും ചെയ്യുക.അവയിലൊന്ന് 70 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സ്ഥിരമായ താപനിലയുള്ള വാട്ടർ ബാത്തിൽ ഇടുക, 1 മണിക്കൂർ ചൂടാക്കുക.മറ്റൊരു ഭാഗം -20 ° C റഫ്രിജറേറ്ററിൽ 1 മണിക്കൂർ സൂക്ഷിക്കുന്നു.സമയം കഴിയുമ്പോൾ, ഇലക്ട്രോഫോറെസിസിനുള്ള രണ്ട് സാമ്പിളുകൾ നീക്കം ചെയ്യുക.ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് പൂർത്തിയായ ശേഷം, രണ്ടിന്റെയും ഇലക്ട്രോഫോറെറ്റിക് ബാൻഡുകൾ താരതമ്യം ചെയ്യുക.രണ്ടിന്റെയും ബാൻഡുകൾ സ്ഥിരതയുള്ളതോ കാര്യമായ വ്യത്യാസമില്ലെങ്കിൽ (തീർച്ചയായും, അവയുടെ ബാൻഡുകളും രീതി 2 ലെ വ്യവസ്ഥകൾ പാലിക്കുന്നു), അതിനർത്ഥം ആർഎൻഎ ലായനിയിൽ അവശേഷിക്കുന്ന RNase മലിനീകരണം ഇല്ലെന്നും ആർഎൻഎയുടെ ഗുണനിലവാരം വളരെ മികച്ചതാണെന്നും ആണ്.നേരെമറിച്ച്, 70 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത സാമ്പിൾ വ്യക്തമായ ഡീഗ്രേഡേഷൻ കാണിക്കുന്നുവെങ്കിൽ, ആർഎൻഎ ലായനിയിൽ RNase മലിനീകരണം ഉണ്ടെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
 
2 ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിനുള്ള പരീക്ഷണാത്മക രീതികളും സാങ്കേതികതകളും
RNA വേർതിരിച്ചെടുക്കുമ്പോൾ നമ്മൾ പലപ്പോഴും നേരിടുന്ന പ്രശ്നങ്ങൾ ഇവയാണ്: (1) RNA വിളവ് കുറവാണ്;(2) ആർഎൻഎയ്ക്ക് ഗുരുതരമായ ഉപ്പ് മലിനീകരണമുണ്ട്;(3) ആർഎൻഎയ്ക്ക് ഗുരുതരമായ ജൈവ ലായക മലിനീകരണമുണ്ട്;(4) സാമ്പിൾ ഡീഗ്രേഡേഷനും മറ്റ് പ്രശ്നങ്ങളും
 
1. സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന മൊത്തം ആർഎൻഎ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ റിയാഗന്റുകൾ
ഗ്വാനിഡിൻ ഐസോത്തിയോസയനേറ്റ് രീതിയും ട്രൈസോൾ രീതിയുമാണ് മൃഗകലകളിൽ നിന്നും മൃഗകോശങ്ങളിൽ നിന്നും മൊത്തം ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ ഏറ്റവും സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന രീതികൾ.മുയലിന്റെ തൊലിയിൽ നിന്നും മൃഗങ്ങളുടെ ബന്ധിത ടിഷ്യുവിൽ നിന്നും മൊത്തം RNA വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നത് പോലെ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ ബുദ്ധിമുട്ടുള്ള ചെറിയ സാമ്പിളുകൾക്കും ടിഷ്യൂകൾക്കും ഇത് പ്രത്യേകിച്ചും അനുയോജ്യമാണ്;കൂടാതെ, ട്രൈസോൾ, ഒരു പൊതു-ഉദ്ദേശ്യ ലിസിസ് റിയാജന്റ് എന്ന നിലയിൽ, സസ്യകലകൾ, ബാക്ടീരിയകൾ, ഫംഗസ്, മറ്റ് ടിഷ്യുകൾ എന്നിവ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിനും ഉപയോഗിക്കാം.കാമെലിയ ഒലിഫെറ, ചായ ഇലകൾ, റാപ്സീഡ് മുതലായവ പോലുള്ള പോളിസാക്രറൈഡുകളും പോളിഫെനോളുകളും അടങ്ങിയ സസ്യകോശങ്ങൾക്ക്, മൊത്തം ആർഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കാനും CTAB രീതി ഉപയോഗിക്കാം.

ഒരു പരമ്പരാഗത രീതി എന്ന നിലയിൽ, ഇരട്ട-നിര രീതി അതിന്റെ സാധാരണ താപനില പ്രവർത്തനവും, RNase ചേർക്കേണ്ട ആവശ്യമില്ല, കൂടാതെ സുരക്ഷയും കാരണം വളരെ ജനപ്രിയമാണ് - ക്ലോറോഫോം, ഫിനോൾ, മറ്റ് ഓർഗാനിക് റിയാഗന്റുകൾ എന്നിവ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ ഇല്ല.(ശുപാർശ ചെയ്യുന്ന ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ )