• ഫേസ്ബുക്ക്
  • ലിങ്ക്ഡ്ഇൻ
  • youtube

മനുഷ്യശരീരത്തിന്റെയും വിവിധ രോഗകാരികളുടെയും ജനിതക വസ്തുക്കളുടെ പ്രകടനവും ഘടനയും കണ്ടെത്തുന്നതിന് മോളിക്യുലർ ഡയഗ്നോസിസ് സാങ്കേതികവിദ്യ മോളിക്യുലർ ബയോളജി രീതികൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു, അങ്ങനെ രോഗങ്ങൾ പ്രവചിക്കുന്നതിനും രോഗനിർണയം നടത്തുന്നതിനുമുള്ള ലക്ഷ്യം കൈവരിക്കുന്നു.

സമീപ വർഷങ്ങളിൽ, മോളിക്യുലാർ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് സാങ്കേതികവിദ്യയുടെ നവീകരണവും ആവർത്തനവും കൊണ്ട്, മോളിക്യുലാർ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക്സിന്റെ ക്ലിനിക്കൽ ആപ്ലിക്കേഷൻ കൂടുതൽ കൂടുതൽ വിപുലവും ആഴത്തിലുള്ളതുമായി മാറിയിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ മോളിക്യുലർ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക്സ് മാർക്കറ്റ് ദ്രുതഗതിയിലുള്ള വികസന കാലഘട്ടത്തിലേക്ക് പ്രവേശിച്ചു.

രചയിതാവ് വിപണിയിലെ പൊതുവായ തന്മാത്രാ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് സാങ്കേതികവിദ്യകളെ സംഗ്രഹിക്കുകയും മൂന്ന് ഭാഗങ്ങളായി തിരിച്ചിരിക്കുന്നു: ആദ്യ ഭാഗം PCR സാങ്കേതികവിദ്യയും രണ്ടാം ഭാഗം ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഐസോതെർമൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സാങ്കേതികവിദ്യയും രണ്ടാം ഭാഗം സീക്വൻസിങ് സാങ്കേതികവിദ്യയും അവതരിപ്പിക്കുന്നു.

01

ഭാഗം I: PCR ടെക്നോളജി

പിസിആർ സാങ്കേതികവിദ്യ

30 വർഷത്തിലേറെ പഴക്കമുള്ള, ഇൻ വിട്രോ ഡിഎൻഎ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സാങ്കേതികവിദ്യകളിൽ ഒന്നാണ് പിസിആർ (പോളിമറേസ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ).

1983-ൽ യുഎസിലെ സെറ്റസിലെ കാരി മുള്ളിസ് ആണ് പിസിആർ സാങ്കേതികവിദ്യയ്ക്ക് തുടക്കമിട്ടത്.മുള്ളിസ് 1985-ൽ പിസിആർ പേറ്റന്റിന് അപേക്ഷിച്ചു, അതേ വർഷം തന്നെ ശാസ്ത്രത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ആദ്യത്തെ പിസിആർ അക്കാദമിക് പേപ്പർ പ്രസിദ്ധീകരിച്ചു.മുള്ളിസിന് 1993-ൽ രസതന്ത്രത്തിനുള്ള നൊബേൽ സമ്മാനം ലഭിച്ചു.

പിസിആറിന്റെ അടിസ്ഥാന തത്വങ്ങൾ

പിസിആറിന് ലക്ഷ്യ ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളെ ഒരു ദശലക്ഷത്തിലധികം തവണ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.ഡിഎൻഎ പോളിമറേസിന്റെ കാറ്റലിസിസ് പ്രകാരം, പാരന്റ് സ്ട്രാൻഡ് ഡിഎൻഎ ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഒരു പ്രത്യേക പ്രൈമർ വിപുലീകരണത്തിന്റെ ആരംഭ പോയിന്റായി ഉപയോഗിക്കുന്നു എന്നതാണ് തത്വം.ഡീനാറ്ററേഷൻ, അനീലിംഗ്, എക്സ്റ്റൻഷൻ തുടങ്ങിയ ഘട്ടങ്ങളിലൂടെ ഇത് വിട്രോയിൽ ആവർത്തിക്കുന്നു.പാരന്റ് സ്‌ട്രാൻഡ് ടെംപ്ലേറ്റ് ഡിഎൻഎയ്ക്ക് പൂരകമായ മകൾ സ്‌ട്രാൻഡ് ഡിഎൻഎയുടെ പ്രക്രിയ.

1

സ്റ്റാൻഡേർഡ് പിസിആർ പ്രക്രിയയെ മൂന്ന് ഘട്ടങ്ങളായി തിരിച്ചിരിക്കുന്നു:

1. ഡിനാറ്ററേഷൻ: ഡിഎൻഎ ഇരട്ട സരണികൾ വേർതിരിക്കുന്നതിന് ഉയർന്ന താപനില ഉപയോഗിക്കുക.ഉയർന്ന ഊഷ്മാവിൽ (93-98°C) ഡിഎൻഎ ഇരട്ട സരണികൾ തമ്മിലുള്ള ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകൾ തകരുന്നു.

2. അനീലിംഗ്: ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ വേർപെടുത്തിയ ശേഷം, പ്രൈമറിന് സിംഗിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയുന്ന തരത്തിൽ താപനില കുറയ്ക്കുന്നു.

3. എക്സ്റ്റൻഷൻ: ഡിഎൻഎ പോളിമറേസ്, താപനില കുറയുമ്പോൾ ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന പ്രൈമറുകളിൽ നിന്ന് ഡിഎൻഎ സ്ട്രോണ്ടുകൾക്കൊപ്പം കോംപ്ലിമെന്ററി സ്ട്രോണ്ടുകൾ സമന്വയിപ്പിക്കാൻ തുടങ്ങുന്നു.വിപുലീകരണം പൂർത്തിയാകുമ്പോൾ, ഒരു സൈക്കിൾ പൂർത്തിയാകും, ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ എണ്ണം ഇരട്ടിയാകുന്നു.

ഈ മൂന്ന് ഘട്ടങ്ങൾ 25-35 തവണ ആവർത്തിക്കുമ്പോൾ, ഡിഎൻഎ ശകലങ്ങളുടെ എണ്ണം ക്രമാതീതമായി വർദ്ധിക്കും.

2

വ്യത്യസ്ത ടാർഗെറ്റ് ജീനുകൾക്കായി വ്യത്യസ്ത പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യാൻ കഴിയും എന്നതാണ് പിസിആറിന്റെ ചാതുര്യം, അതിനാൽ ടാർഗെറ്റ് ജീൻ ശകലങ്ങൾ ചുരുങ്ങിയ സമയത്തിനുള്ളിൽ വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും.

ഇതുവരെ, പിസിആറിനെ സാധാരണ പിസിആർ, ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ, ഡിജിറ്റൽ പിസിആർ എന്നിങ്ങനെ മൂന്ന് വിഭാഗങ്ങളായി തിരിക്കാം.

സാധാരണ പിസിആറിന്റെ ആദ്യ തലമുറ

ടാർഗെറ്റ് ജീൻ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് ഒരു സാധാരണ PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉപകരണം ഉപയോഗിക്കുക, തുടർന്ന് ഉൽപ്പന്നം കണ്ടെത്തുന്നതിന് അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ഉപയോഗിക്കുക, ഗുണപരമായ വിശകലനം മാത്രമേ ചെയ്യാൻ കഴിയൂ.

ആദ്യ തലമുറ PCR ന്റെ പ്രധാന പോരായ്മകൾ:

നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും തെറ്റായ പോസിറ്റീവ് ഫലങ്ങളും ഉണ്ടാകാനുള്ള സാധ്യത.

- കണ്ടെത്തൽ വളരെ സമയമെടുക്കും, ഓപ്പറേഷൻ ബുദ്ധിമുട്ടുള്ളതുമാണ്.

- ഗുണപരമായ പരിശോധന മാത്രമേ നടത്താൻ കഴിയൂ.

രണ്ടാം തലമുറ ഫ്ലൂറസെൻസ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആർ

ഫ്ലൂറസെൻസ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് PCR (റിയൽ-ടൈം PCR), qPCR എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു, ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലുകളുടെ ശേഖരണത്തിലൂടെ ആംപ്ലിഫൈഡ് ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ശേഖരണം നിരീക്ഷിക്കാൻ, പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിന്റെ പുരോഗതിയെ സൂചിപ്പിക്കാൻ കഴിയുന്ന ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബുകൾ ചേർത്ത് ഫലങ്ങൾ നിർണ്ണയിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്നു.

qPCR സാങ്കേതികവിദ്യ ഒരു അടച്ച സംവിധാനത്തിൽ നടപ്പിലാക്കുന്നതിനാൽ, മലിനീകരണത്തിന്റെ സാധ്യത കുറയുന്നു, കൂടാതെ ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നൽ അളവ് കണ്ടെത്തുന്നതിന് നിരീക്ഷിക്കാൻ കഴിയും, അതിനാൽ ഇത് ക്ലിനിക്കൽ പ്രാക്ടീസിൽ ഏറ്റവും വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കപ്പെടുന്നതും പിസിആറിലെ പ്രബലമായ സാങ്കേതികവിദ്യയായി മാറിയിരിക്കുന്നു.

തത്സമയ ഫ്ലൂറസെന്റ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പിസിആറിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഫ്ലൂറസെന്റ് പദാർത്ഥങ്ങളെ ഇവയായി തിരിക്കാം: തക്മാൻ ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബുകൾ, മോളിക്യുലർ ബീക്കണുകൾ, ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈകൾ.

1) തക്മാൻ ഫ്ലൂറസെന്റ് അന്വേഷണം:

പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സമയത്ത്, ഒരു ജോടി പ്രൈമറുകൾ ചേർക്കുമ്പോൾ ഒരു പ്രത്യേക ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബ് ചേർക്കുന്നു.അന്വേഷണം ഒരു ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡാണ്, രണ്ട് അറ്റങ്ങളും യഥാക്രമം റിപ്പോർട്ടർ ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പും ഒരു ക്വഞ്ചർ ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പും ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്തിരിക്കുന്നു.

അന്വേഷണം കേടുകൂടാതെയിരിക്കുമ്പോൾ, റിപ്പോർട്ടർ ഗ്രൂപ്പ് പുറപ്പെടുവിക്കുന്ന ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നൽ ക്വഞ്ചിംഗ് ഗ്രൂപ്പ് ആഗിരണം ചെയ്യുന്നു;പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സമയത്ത്, ടാക്ക് എൻസൈമിന്റെ 5′-3′ എക്സോന്യൂക്ലീസ് പ്രവർത്തനം അന്വേഷണത്തെ പിളർത്തുകയും ഡീഗ്രേഡ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് റിപ്പോർട്ടർ ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പും ക്വൻസറും ആക്കുന്നു, ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പിനെ വേർതിരിക്കുന്നു, അങ്ങനെ ഫ്ലൂറസെൻസ് മോണിറ്ററിംഗ് സിസ്റ്റത്തിന് ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നൽ സ്വീകരിക്കാൻ കഴിയും, അതായത്, ഓരോ തവണയും ഡി.എൻ.എ. ഫ്ലൂറസെൻസ് സിഗ്നലിന്റെ ലേഷൻ പിസിആർ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ രൂപീകരണവുമായി പൂർണ്ണമായും സമന്വയിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു.

2) SYBR ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈകൾ:

PCR പ്രതികരണ സംവിധാനത്തിൽ, SYBR ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈ അധികമായി ചേർക്കുന്നു.SYBR ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈ ഡിഎൻഎ ഡബിൾ സ്‌ട്രാൻഡിൽ പ്രത്യേകമായി ഉൾപ്പെടുത്താത്തതിന് ശേഷം, അത് ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നൽ പുറപ്പെടുവിക്കുന്നു.ശൃംഖലയിൽ ഉൾപ്പെടുത്താത്ത SYBR ഡൈ തന്മാത്ര ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലും പുറപ്പെടുവിക്കില്ല, അതുവഴി ഫ്ലൂറസന്റ് സിഗ്നൽ ഉറപ്പാക്കുന്നു PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ വർദ്ധനവ് PCR ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ വർദ്ധനവുമായി പൂർണ്ണമായും സമന്വയിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു.SYBR ഇരട്ട സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎയുമായി മാത്രമേ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നുള്ളൂ, അതിനാൽ PCR പ്രതികരണം നിർദ്ദിഷ്ടമാണോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ ഉരുകൽ വക്രം ഉപയോഗിക്കാം.

3 4

3) മോളിക്യുലാർ ബീക്കണുകൾ

ഇത് ഒരു സ്റ്റെം-ലൂപ്പ് ഡബിൾ-ലേബൽ ഒലിഗോ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് പ്രോബ് ആണ്, ഇത് 5, 3 അറ്റങ്ങളിൽ ഏകദേശം 8 ബേസുകളുള്ള ഒരു ഹെയർപിൻ ഘടന ഉണ്ടാക്കുന്നു.രണ്ട് അറ്റത്തിലുമുള്ള ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് സീക്വൻസുകൾ പരസ്പര പൂരകമായി ജോടിയാക്കുന്നു, ഇത് ഫ്ലൂറസെന്റ് ഗ്രൂപ്പും ക്വഞ്ചിംഗ് ഗ്രൂപ്പും ഇറുകിയതാക്കുന്നു.അടയ്ക്കുക, അത് ഫ്ലൂറസെൻസ് ഉണ്ടാക്കില്ല.

5

പിസിആർ ഉൽപന്നം ഉൽപ്പാദിപ്പിച്ച ശേഷം, അനീലിംഗ് പ്രക്രിയയിൽ, തന്മാത്രാ ബീക്കണിന്റെ മധ്യഭാഗം ഒരു പ്രത്യേക ഡിഎൻഎ സീക്വൻസുമായി ജോടിയാക്കുന്നു, ഫ്ലൂറസെന്റ് ജീനിനെ ഫ്ലൂറസെൻസ് ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിന് ക്വഞ്ചർ ജീനിൽ നിന്ന് വേർതിരിക്കുന്നു.

6

രണ്ടാം തലമുറ PCR ന്റെ പ്രധാന പോരായ്മകൾ:

സംവേദനക്ഷമത ഇപ്പോഴും കുറവാണ്, കൂടാതെ കുറഞ്ഞ പകർപ്പ് മാതൃകകൾ കണ്ടെത്തുന്നത് കൃത്യമല്ല.

പശ്ചാത്തല മൂല്യത്തിന്റെ സ്വാധീനമുണ്ട്, ഫലം ഇടപെടലിന് വിധേയമാണ്.

മൂന്നാം തലമുറ ഡിജിറ്റൽ പിസിആർ

ഡിജിറ്റൽ PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) എൻഡ്-പോയിന്റ് ഡിറ്റക്ഷനിലൂടെ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസിന്റെ പകർപ്പ് നമ്പർ കണക്കാക്കുന്നു, കൂടാതെ ആന്തരിക നിയന്ത്രണങ്ങളും സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവുകളും ഉപയോഗിക്കാതെ കൃത്യമായ സമ്പൂർണ്ണ അളവ് കണ്ടെത്തൽ നടത്താൻ കഴിയും.

ഡിജിറ്റൽ PCR എൻഡ്‌പോയിന്റ് കണ്ടെത്തൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു, അത് Ct മൂല്യത്തെ (സൈക്കിൾ ത്രെഷോൾഡ്) ആശ്രയിക്കുന്നില്ല, അതിനാൽ ഡിജിറ്റൽ PCR പ്രതികരണത്തെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത ബാധിക്കില്ല, കൂടാതെ PCR പ്രതികരണ ഇൻഹിബിറ്ററുകളോടുള്ള സഹിഷ്ണുത ഉയർന്ന കൃത്യതയും പുനരുൽപാദനക്ഷമതയും മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നു.

ഉയർന്ന സംവേദനക്ഷമതയുടെയും ഉയർന്ന കൃത്യതയുടെയും സവിശേഷതകൾ കാരണം, ഇത് പിസിആർ റിയാക്ഷൻ ഇൻഹിബിറ്ററുകളാൽ എളുപ്പത്തിൽ ഇടപെടില്ല, കൂടാതെ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഉൽപ്പന്നങ്ങളില്ലാതെ ഇതിന് യഥാർത്ഥ സമ്പൂർണ്ണ അളവ് കൈവരിക്കാൻ കഴിയും, ഇത് ഒരു ഗവേഷണ-ആപ്ലിക്കേഷൻ ഹോട്ട്‌സ്‌പോട്ടായി മാറിയിരിക്കുന്നു.

പ്രതികരണ യൂണിറ്റിന്റെ വിവിധ രൂപങ്ങൾ അനുസരിച്ച്, അതിനെ മൂന്ന് തരങ്ങളായി തിരിക്കാം: മൈക്രോഫ്ലൂയിഡിക്, ചിപ്പ്, ഡ്രോപ്ലെറ്റ് സിസ്റ്റങ്ങൾ.


പോസ്റ്റ് സമയം: ജൂലൈ-08-2021